《三棱中肽類活性化合物的套用》是廣東藥學院於2013年10月7日申請的專利，該專利的公布號為CN103536899A，授權公布日為2014年1月29日，發明人是梁生旺、王淑美、鄧小慧、陳舒茵、劉貝、胡旭光、閆天磊。
《三棱中肽類活性化合物的套用》公開了一種三棱中肽類活性化合物在製備抗凝血和/或抗血栓藥物中的套用，所述肽類活性化合物結構式如式（Ⅰ）所示。該發明首次提供從三棱中分離純化得到所述肽類化合物並提供了套用。所述化合物對凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血酶原時間（APTT）和凝血酶時間（TT）有延長趨勢作用，具有很好的抗凝血活性，為抗血栓天然藥物的開發提供了有力的依據。
2020年7月14日，《三棱中肽類活性化合物的套用》獲得第二十一屆中國專利獎優秀獎。
（概述圖為《三棱中肽類活性化合物的套用》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：三棱中肽類活性化合物的套用
- 申請人：廣東藥學院
- 申請日：2013年10月7日
- 申請號：2013104869473
- 公布號：CN103536899A
- 公布日：2014年1月29日
- 發明人：梁生旺、王淑美、鄧小慧、陳舒茵、劉貝、胡旭光、閆天磊
- 地址：廣東省廣州市大學城外環東路280號
- Int. Cl.：A61K38/12(2006.01)I、A61P7/02(2006.01)I
- 代理機構：廣州粵高專利商標代理有限公司
- 代理人：任重
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
中藥三棱為黑三棱科植物黑三棱Sparganium stoloniferum Buch.-Ham的乾燥塊莖，首載於《本草拾遺》，現為《中國藥典》收載，其味苦、性平，入肝、脾經，具有破血行氣、消積止痛等功能。中醫除單用生品、醋製品外，常配伍莪術、黃芪等增強療效。
現代藥理研究表明，在35種常用活血化瘀藥當中，三棱的作用強度位居前10位，並被廣泛套用於心腦血管疾病，腫瘤及婦科各類疾病的治療。特別是對於子宮肌瘤、子宮內膜異位症等婦科疑難病，三棱顯示了較強的活血破氣、消散疲瘸的治療作用，顯示了其在婦科、腫瘤、肝病及心腦血管疾病等方面的廣泛開發利用前景。
但是，三棱的化學成分複雜，含有黃酮和黃酮苷、苯丙素苷、甾體及其苷、有機酸等化合物，雖然現代化學和藥理研究已部分闡明了化學成分和臨床套用之間的聯繫，但是還有很多活性成分未被找到，很多藥理研究也僅停留在提取物階段，限制了三棱化合物的進一步推廣套用。因此進一步揭示三棱中化學成分與臨床醫學套用之間的聯繫，對於指導臨床用藥和新藥開發有非常重要的意義。
發明內容
專利目的
《三棱中肽類活性化合物的套用》要解決的技術問題是填補2013年之前的三棱化合物套用技術的不足，提供三棱中肽類活性化合物的套用。
技術方案
《三棱中肽類活性化合物的套用》的發明目的通過以下技術方案予以實現：
提供了一種三棱中肽類活性化合物在製備抗凝血和/或抗血栓藥物中的套用，所述化合物的結構式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）
進一步地，所述三棱中肽類活性化合物包括式（Ⅰ）所示化合物的對映體、互變異構體、生理官能衍生物或藥學上可接受的鹽。
優選地，所述三棱中肽類活性化合物為環-（酪氨酸-亮氨酸）[cyclo-（Tyr-Leu）]。
所述化合物可以採用化學合成方法獲得。《三棱中肽類活性化合物的套用》同時提供了一種提取純化方法製備得到所述化合物，包括以下步驟：
S1.稱取三棱藥材，粉碎，加入乙醇提取，提取液經減壓回收溶劑後，得到乙醇浸膏；經過該發明不斷實驗總結得到，採用60%（v/v）的乙醇對三棱藥材提取的提取率最高，優選採用60%（v/v）的乙醇；
S2.將乙醇浸膏用水分散，用乙酸乙酯萃取，合併乙酸乙酯部分，減壓回收溶劑後，得乙酸乙酯浸膏；
S3.採用矽膠色譜柱對乙酸乙酯浸膏進行分離，以氯仿-甲醇溶劑系統進行梯度洗脫，Fr41-43合併，經矽膠柱層析細分，以氯仿-甲醇溶劑25:1、20:1、10:1系統進行梯度洗脫，Fr 5-7合併，室溫放置後析出白色針狀結晶，即得化合物環-（酪氨酸-亮氨酸）。
採用《三棱中肽類活性化合物的套用》提取方法製備得到的化合物具有良好的抗凝血作用，可以很好地套用於製備抗血栓藥物方面。
有益效果
《三棱中肽類活性化合物的套用》總結了科學的工藝條件，採用適宜的方法從中藥三棱中首次分離得到了一種環二肽類活性化合物，並經過大量實驗證實了其對凝血酶原時間（prothrombin time， PT）、活化部分凝血激酶時間（activated partial thrombop lastintime，APTT）及凝血酶時間（thrombin time，TT）有延長趨勢，具有很好的抗凝血活性，填補了2013年之前的技術空白，為抗血栓天然藥物的開發提供了新的依據。
附圖說明
圖1為三棱有效部位的提取路線圖。
圖2為乙酸乙酯部位的粗分流程圖。
圖3為Fr41-43段的細分流程圖。
圖4《三棱中肽類活性化合物的套用》化合物的C-NMR譜圖。
圖5《三棱中肽類活性化合物的套用》化合物的H-NMR譜圖。
圖6《三棱中肽類活性化合物的套用》化合物對凝血酶原時間的影響結果圖。
圖7《三棱中肽類活性化合物的套用》化合物對活化部分凝血酶原時間的影響結果圖。
圖8《三棱中肽類活性化合物的套用》化合物對凝血酶時間的影響結果圖。
圖9《三棱中肽類活性化合物的套用》化合物的HMBC相關信號。
圖10《三棱中肽類活性化合物的套用》化合物的HMBC相關信號。
圖11《三棱中肽類活性化合物的套用》化合物平面結構示意圖。
技術領域
《三棱中肽類活性化合物的套用》涉及醫藥技術領域，更具體地，涉及一種三棱中肽類活性化合物的套用。
權利要求
1.三棱中肽類活性化合物在製備抗凝血和/或抗血栓藥物中的套用，所述化合物的結構式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）
2.根據權利要求1所述的套用，其特徵在於，所述三棱中肽類活性化合物包括式（Ⅰ）所示化合物的對映體、互變異構體、生理官能衍生物或藥學上可接受的鹽。
3.根據權利要求1所述的套用，其特徵在於，所述三棱中肽類活性化合物為環-（酪氨酸-亮氨酸）。
4.根據權利要求3所述的套用，其特徵在於，所述環-（酪氨酸-亮氨酸）是通過以下步驟提取純化製備得到：
S1.稱取三棱藥材，粉碎，加入60%乙醇提取，提取液經減壓回收溶劑後，得到乙醇浸膏；
S2.將乙醇浸膏用水分散，用乙酸乙酯萃取，合併乙酸乙酯部分，減壓回收溶劑後，得乙酸乙酯浸膏；
S3.採用矽膠色譜柱對乙酸乙酯浸膏進行分離，以氯仿-甲醇溶劑系統進行梯度洗脫，Fr41-43合併，經矽膠柱層析細分，以氯仿-甲醇溶劑25:1、20:1、10:1系統進行梯度洗脫，Fr 5-7合併，室溫放置後析出白色針狀結晶，即得化合物環-（酪氨酸-亮氨酸）。
實施方式
實施例1 式（Ⅰ）所示化合物的提取、分離純化和結構鑑定
1、實驗材料：
（1）藥材
三棱藥材購自廣州致信藥業有限公司，批號為090301，經廣東藥學院中藥學院中藥鑑定教研室李書淵教授鑑定為黑三棱科黑三棱屬植物黑三棱Sparganium stoloniferum Buch.-Ham削去外皮的乾燥塊莖。
（2）試劑和填料
氯仿（分析純，天津市富宇精細化工有限公司）；
甲醇（分析純，天津市富宇精細化工有限公司）；
香草醛（廣州廣聯津化工廠）；
柱層析用矽膠（80-100目，100-200目，200-300目，青島海洋化工廠）；
薄層層析矽膠（矽膠G，青島海洋化工有限公司）；
硫酸（分析純，上海申翔化學試劑有限公司）；
羧甲基纖維素鈉CMC-Na（上海康達化工技術服務部）。
（3）實驗儀器
6202小型高速粉碎機（北京環亞天元機械技術有限公司）；
EC-1500/VC-600型自動提取濃縮機（台灣元成機械股份有限公司）；
AGX1-2001-P型艾科浦（Aquapro）超純水系統（重慶頤洋企業發展有限公司）；
RE-52A型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；
SHZ-D型循環水式真空泵（河南鞏義市英峪儀器廠）；
GZX數顯鼓風乾燥箱（上海博訊醫療設備廠）；
DLSB型低溫冷卻液循環泵（鄭州長城科工貿有限公司）；
KQ-100型超音波清洗器（崑山市超聲儀器有限公司）；
日本Yanaco MP-S3型顯微熔點測定儀；
電熱恆溫水浴鍋（HHS型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；
薄層自動塗敷器（YOKO-BF，武漢藥科新技術開發公司）；
超導脈衝傅立葉變換核磁共振光譜儀：Bruker AVANCE AV 500；
超導脈衝傅立葉變換核磁共振光譜儀：Varian UNITY INOVA 500。
2、藥材的提取：
提取工藝路線圖如附圖1所示。取中藥三棱的乾燥塊莖14千克，粉碎成粗粉，置多功能提取罐中，用60%（v/v）乙醇加熱回流提取三次，每次兩小時，過濾，合併續濾液，回收乙醇，乾燥，得總浸膏752克。將總浸膏混懸於水中，超聲20分鐘，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，合併各萃取液，減壓回收，得石油醚部位浸膏26克，氯仿部位浸膏34克，乙酸乙酯部位浸膏11.5克，正丁醇部位浸膏42克。
3、成分的分離純化：
將所得乙酸乙酯部位11.5克浸膏，使用約50毫升乙酸乙酯溶解樣品，乾法拌樣，經矽膠（200～300目）柱層析粗分，以氯仿-甲醇溶劑系統進行梯度（100:1，20:1，10:1，5:1，體積比）洗脫，TLC檢視，合併薄層行為相同的流份。附圖2所示為乙酸乙酯部位的粗分流程圖。附圖2中，方框中字母C代表《三棱中肽類活性化合物的套用》化合物。
將Fr41-43合併的流份，減壓濃縮，用適量氯仿溶解，乾法拌樣，經矽膠（200～300目）柱層析細分，以氯仿-甲醇溶劑系統（25:1、20:1、10:1，體積比）進行梯度洗脫，TLC檢視，合併相同的流份，Fr 5-7合併，室溫放置後析出白色針狀結晶，即得化合物環-（酪氨酸-亮氨酸）。附圖3所示為Fr41-43段的細分流程圖，方框中字母C代表該發明化合物。
上述方法分離得到的化合物的結構鑑定：
白色針晶（MeOH），mp296.0～297.0℃，茚三酮反應呈陰性，6摩爾·升-1鹽酸水解後對茚三酮反應呈陽性，提示該化合物可能為肽類化合物。H-NMR （500MHz，DMSO）譜中，給出環二肽醯胺質子信號，出現在δ 8.03（2H，s，2-NH），相應的C-NMR（125MHz，DMSO）譜給出了2個羰基信號，出現在δ 167.4、166.2，提示該化合物可能是環二肽。H-NMR譜中，δ 6.89（2H，d，J=8.7 Hz，H-9）、6.64（2H，d，J=8.71Hz，H-10）為2個對位取代苯環上的質子信號，δ 9.21（1H，S，-OH）為苯環上的羥基質子信號；高場區給出δ 3.02（1H，brd，J = 13.8Hz，Hα-7 ）、2.69（1H，brd，J=13.8Hz，Hβ-7）。HMBC譜中，δ 2.69（Hα-7），3.02（Hβ-7）與苯環上δ 131.3（C-9）碳信號存在遠程相關，由此推斷分子中存在一個酪氨酸結構片段。H-NMR譜中，高場區給出2個甲基質子信號δ 0.65（3H，d，J=6.0Hz，H-15）、0.64（3H，d，J=6.0Hz，H-16），1個次甲基信號1.41（1H，m，H-14）提示存在異丙基結構，由此可以推斷，分子中的另一個胺基酸片段為亮氨酸片段。根椐以上分析，判斷該化合物為環-（酪氨酸-亮氨酸）。其H-NMR、C-NMR譜數據與已有報導的環（酪氨酸-亮氨酸）對照基本一致，故鑑定化合物為環-（酪氨酸-亮氨酸） （cyclo（Tyr-，Leu））。在該化合物的結構中，亮氨酸支鏈上的氫化學位移不同程度地向高場偏移，2 個甲基移至 0.65 ，而CH2 2 個H 化學位移移向更高場， 1 個移至 0.14 ，另 1 個為 0.74 ，這么明顯的位移現象比較罕見。Kenneth等對環二肽的構象進行過研究，發現有芳環支鏈的環二肽可能存在摺疊構象。產生摺疊的原因有可能是偶極- 誘導偶極相互作用和色散力作用。2 個醯胺鍵提供2 個偶極，而苯環提供可極化的 π體系。摺疊構象使亮氨酸支鏈受苯環的禁止影響，氫化學位移向高場偏移。
《三棱中肽類活性化合物的套用》所述化合物的HMBC相關信號見附圖9和附圖10所示。HMBC中，δ 0.14（1H，m）與δ23.0，52.3的碳信號存在相關；δ 0.65（3H，d，J=6.0Hz）與δ 21.4，23.0的碳信號存在相關；δ 0.74（3H，d，J=6.0Hz）與δ21.4，23.0，43.7的碳信號存在相關；δ 2.69，3.02（1H，dd，J=13.8Hz）與δ 55.7，125.8，131.2的碳信號存在相關；δ 6.64（2H，d，J=8.7Hz）與δ 114.8，125.8，156.3的碳信號存在相關；δ 6.89（2H，d，J=8.7Hz）與δ 114.8，131.2，156.3的碳信號存在相關；δ 9.21（1H，s）與δ 114.8， 156.3的碳信號存在相關。
通過二維核磁中質子與碳原子的相關信號，可以確定附圖11所示平面結構的存在。
該化合物結構數據見表1。根據上述波譜數據，確定該化合物為環-（酪氨酸-亮氨酸）。
表1 環-（酪氨酸-亮氨酸）C和H的數據歸屬
表1 環-（酪氨酸-亮氨酸）C和H的數據歸屬
所述化合物的結構式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）
實施例2 該發明所述化合物抗凝血功能試驗
1、實驗材料
（1）藥物
實施例1製備得到的環二肽環-（酪氨酸-亮氨酸）。
（2）動物
SD大鼠，體重180～250克，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。
（3）試劑
肝素（sigma，批號：20120509）；
水合氯醛（廣州思樂生化試劑有限公司）；
凝血酶原時間PT 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20130314）；
活化部分凝血激酶時間APTT試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20130201）；
凝血酶時間TT試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20130314）；
生理鹽水（貴州天地藥業有限公司，批號A13011209）；
二甲基亞碸（DMSO）（分析純，廣州化學試劑廠）；
枸櫞酸鈉（分析純，天津市百世化工有限公司，批號：0110）。
（4）實驗儀器
台式離心機（北京醫用離心機廠）；
電熱恆溫水浴鍋（HHS型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；
FA1104型電子分析天平（上海天平儀器廠）；
秒表（上海星鑽秒表有限公司）；
EP管（上海申翔化學試劑有限公司）；
移液槍（北京華匯通科技發展有限公司）；
注射器（上海楚定分析儀器有限公司）。
2、實驗方法：
（1）血漿製備
大鼠用10%水合氯醛（350毫克/千克）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，分裝於含0.4毫升，109毫摩爾/升枸櫞酸鈉抗凝液的塑膠離心管，每管3.6毫升，立即輕輕顛倒混勻。3000轉離心15分鐘，收集上清，即得貧血小板血漿（PPP），在2小時內進行實驗，或-20℃凍存備用。
（2）抗凝活性測定
將實施例1製備的化合物用DMSO溶解成濃度為0.5毫克/毫升、1.0毫克/毫升、2.0毫克/毫升、4.0毫克/毫升的溶液，手工法測定各肽的APTT、PT和TT值。
將實施例1製備的化合物進行對凝血酶原時間、活化部分凝血激酶時間和的影響凝血酶時間的影響實驗。具體實驗操作分別按照凝血酶原時間PT試劑盒、活化部分凝血激酶時間APTT試劑盒以及凝血酶時間TT試劑盒說明進行操作。
（3）結果記錄
加入相應試劑立即混勻並開動秒表，試管仍浸於水浴中，至約10秒時取出，
每隔2秒向上挑動至生成固體細絲終止計時，重複以上操作3次，取均值即得PT、APTT或TT時間。
3、實驗結果和評價：
結果見表2和附圖6～8所示。
表2
表2
結果顯示，在凝血功能方面，受試化合物組的PT、APTT和TT值較空白組均有延長趨勢，說明該發明化合物具有抗凝血的作用。
《三棱中肽類活性化合物的套用》從中藥三棱中分離得到的化合物對凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血激酶時間（APTT）及凝血酶時間（TT）有延長趨勢，具有很好的抗凝血活性，為抗血栓天然藥物的開發提供了有力的依據。
榮譽表彰
2020年7月14日，《三棱中肽類活性化合物的套用》獲得第二十一屆中國專利獎優秀獎。
