丁酸梭菌與仔豬結腸黏膜上皮細胞互作分子機制的研究

《丁酸梭菌與仔豬結腸黏膜上皮細胞互作分子機制的研究》是依託浙大寧波理工學院，由王進波擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：丁酸梭菌與仔豬結腸黏膜上皮細胞互作分子機制的研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：王進波
• 依託單位：浙大寧波理工學院

項目摘要

本課題運用螢光定量PCR及Western-blotting技術研究丁酸梭菌與仔豬結腸黏膜上皮細胞模式識別受體（包括TLRs和NODs）的作用，探究丁酸梭菌對仔豬結腸上皮細胞中NF-κB炎症信號通路IKK、IL-2、IL-8、TNF-α及炎症抑制因子IL-10、PPARs、Hsp等相關基因表達的影響，從而初步明確丁酸梭菌與結腸上皮細胞互作的分子機制。本課題運用Western-blotting、螢光免疫技術，研究丁酸梭菌對致病性大腸桿菌所致的結腸黏膜上皮細胞死亡與細胞骨架F-actin裂解的抑制作用，探索丁酸梭菌與結腸黏膜上皮細胞表面integrin β1、E Cadherin的互作機制，從而確定丁酸梭菌抑制有害菌侵襲定植的分子機制。這對揭示丁酸梭菌與結腸黏膜上皮細胞互作及其抑制腸道有害菌定植、侵襲的分子機制具有重要意義，為益生菌在動物生產中的套用奠定理論基礎。

結題摘要

試驗一：研究了丁酸梭菌對跨膜受體TLRs和炎性因子表達水平的影響。結果顯示，丁酸梭菌能夠顯著提高TLR2 mRNA的表達水平，但不影響TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、MyD88的表達；NF-κB、IL-8、TNF-α的表達量亦顯著提高，說明HT-29細胞被誘導發生了免疫反應。與大腸桿菌相比，丁酸梭菌誘導的NF-κB、IL-8、TNF-α的表達水平卻低很多。另外，丁酸梭菌能夠顯著提高IL-10和Hsp70的表達量，這可能和丁酸梭菌的益生特性有關。試驗二：本試驗用siRNA敲除TLR2和MyD88基因。沉默MyD88基因對丁酸梭菌誘導的NF-κB、IL-8、IL-6、TNF-α的表達沒有影響，但是沉默TLR2基因會導致NF-κB、IL-8、IL-6、TNF-α的表達下降，說明TLR2是丁酸梭菌的特異性受體。因此，丁酸梭菌可激活由TLR2介導的MyD88-非依賴性信號傳導通路。試驗三：用IL-10特異性siRNA和IL-10抗體處理細胞，用以敲除或中和IL-10。結果顯示，中和或敲除IL-10促進丁酸梭菌誘導的NF-κB的活化和IL-8的表達。另外發現IL-10被中和後，丁酸梭菌能夠誘導HT-29細胞發生嚴重的凋亡和壞死。結果說明，IL-10在腸道寄主細胞識別丁酸梭菌及丁酸梭菌調節的免疫保護中發揮著重要作用。試驗四：首先，測定丁酸梭菌和其SCS對EPEC（致病大腸桿菌）的生長、粘附的抑制作用；結果顯示，丁酸梭菌和其SCS有顯著抑制效果。另一方面，丁酸梭菌和其SCS能夠抑制EPEC引發的道細胞凋亡。同時發現，丁酸梭菌可通過調節XIAP、BclXL、FAS、Bcl2、BAX、P53的表達和抑制caspase-9、caspase-3的活力緩解EPEC誘導的細胞凋亡。結果表明，丁酸梭菌既可直接的抑制EPEC的活力，又可間接通過調節凋亡因子的表達抑制EPEC誘導的細胞凋亡，從而發揮對EPEC誘導的腸道炎症的抑制作用。本研究初步揭示了丁酸梭菌的粘附定植機制與免疫調節機理，闡明了其發揮益生作用的機理。試驗五：動物實驗表明，丁酸梭菌能夠抑制EPEC誘導的仔豬腸黏膜上皮細胞NF-κB、IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α等炎症因子表達，刺激炎症抑制因子IL-10的表達，抑制EPEC刺激的炎症反應，從而發揮免疫調節作用。