《一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法》是廣東省微生物研究所和廣東環凱微生物科技有限公司於2014年3月20日申請的專利，該專利的申請號為2014101058048，公布號為CN103897001A，授權公布日為2014年7月2日，發明人是吳清平、馬延霞、張菊梅、郭偉鵬、蔡芷荷、盧勉飛。
《一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法》公開了一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法。其包括以下步驟：第一步，4-甲基傘形酮的製備；第二步，四乙醯基-α-D-吡喃半乳糖的製備；第三步，4-甲基傘形酮基-2,3,4,6-四乙醯基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備；第四步，4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備。該發明提供的方法反應條件溫和，室溫下反應即可；無需使用重金屬鹽類，環境友好；產率高，糖苷化一步產率可達73.1%，總產率達32.9%。微生物實驗證明，產品和進口底物效果相當，可以替代進口產品。
2018年12月20日，《一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法》獲得第二十屆中國專利優秀獎。
（概述圖為《一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法
- 公告號：CN103897001A
- 授權日：2014年7月2日
- 申請號：2014101058048
- 申請日：2014年3月20日
- 申請人：廣東省微生物研究所、廣東環凱微生物科技有限公司
- 地址：廣東省廣州市先烈中路100號
- 發明人：吳清平、馬延霞、張菊梅、郭偉鵬、蔡芷荷、盧勉飛
- Int.Cl.：C07H17/075(2006.01)I; C07H1/00(2006.01)I
- 代理機構：廣州科粵專利商標代理有限公司
- 代理人：劉明星
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
截至2014年3月20日，食品安全關係到人類的生命健康，已經在全世界範圍內引起高度重視。而食源性致病菌是引起食源性疾病的重要原因，是食品安全的重大隱患。因此及時有效地檢測食品中污染的食源性致病菌對於預防和控制食源性疾病具有重要意義。
截至2014年3月20日，顯色培養基技術已成功套用於微生物檢測。這種技術可以實現對微生物的快速檢測和鑑定，且具有準確、靈敏性高等優點。4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷（MU-Gal）是一種重要的螢光底物，常被用來檢測水和食物中的大腸菌群。大腸菌群代謝過程中產生的β-半乳糖苷酶能將4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷分解，釋放出螢光團4-甲基傘形酮（4-MU），紫外燈下照射產生藍色的螢光。中國國內所使用的MU-Gal主要依靠進口，價格昂貴，且有關MU-Gal詳細的合成報導和專利很少見。
酚類糖苷化用到的給體主要有鹵苷給體、端位乙醯基給體和三氯乙醯亞胺給體。其中用的最多的是鹵苷給體。K.F.CHILVERS和J.D.PERRY等人用Koenigs-Knorr法合成了MU-Gal，催化劑是銀鹽或者汞鹽，反應過程中，溴苷易分解，反應時間長達2-3天，且採用的重金屬促進劑會產生大量對環境不友好的廢液，具體產率不詳。朱佳玲等人將4-甲基傘形酮、氫氧化鉀和全乙醯溴代半乳糖加入到N，N-二甲基甲醯胺中反應，縮短了反應時間，糖苷化一步反應產率達43%。
發明內容
專利目的
《一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法》的目的是提供一種產率高、反應時間短，成本低廉，反應條件溫和的4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法。
技術方案
《一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法》的4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟：
a、4-甲基傘形酮的合成：將間苯二酚和乙醯乙酸乙酯溶解後滴加到濃硫酸中進行反應，反應後將反應液倒入冰水中攪拌，析出固體，過濾重結晶，得到4-甲基傘形酮；
b、四乙醯基-α-D-溴代半乳糖的合成：β-D-半乳糖五乙酸酯中加入33%～35%的氫溴酸-醋酸溶液下反應後倒入冰水中，析出固體，過濾並用冰水洗滌，二氯甲烷提取，飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，再飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，濃縮得黃色黏稠狀液體，加入無水乙醚後冷凍結晶，再抽濾得四乙醯基-α-D-溴代半乳糖；
c、4-甲基傘形酮基-2，3，4，6-四乙醯基-β-D-吡喃半乳糖苷的合成：4-甲基傘形酮和四丁基溴化銨，溶於氫氧化鈉溶液中；四乙醯基-α-D-溴代半乳糖溶於三氯甲烷中，然後滴加到含有4-甲基傘形酮和四丁基溴化銨的氫氧化鈉溶液中，室溫下反應後，分出有機層，用氫氧化鈉溶液洗滌後無水硫酸鈉乾燥，旋蒸除溶劑得到黃色粘稠液體，矽膠柱層析得4-甲基傘形酮基-2，3，4，6-四乙醯基-β-D-吡喃半乳糖苷；
d、4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的合成：4-甲基傘形酮基-2，3，4，6-四乙醯基-β-D-吡喃半乳糖苷溶於甲醇中，與碳酸鈉水溶液反應，然後過濾，冷甲醇洗滌，無水乙醇重結晶，得到4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷。
優選，步驟a中，所述的將間苯二酚和乙醯乙酸乙酯溶解後滴加到濃硫酸中進行反應，其濃硫酸為體積分數75%濃硫酸，其反應時間為12小時。
優選，步驟b中，所述的β-D-半乳糖五乙酸酯中加入33%～35%的氫溴酸-醋酸溶液，其投料比為β-D-半乳糖五乙酸酯:氫溴酸-醋酸溶液=1克:（1.5～2）毫升，反應4小時。
優選，步驟c中，所述的室溫下反應後，其反應時間優選為16小時，所述的4-甲基傘形酮、四丁基溴化銨和四乙醯基-α-D-溴代半乳糖的用量的物質的量比為：5:3:6，所述的四乙醯基-α-D-溴代半乳糖溶於三氯甲烷中，然後滴加到含有4-甲基傘形酮和四丁基溴化銨的氫氧化鈉溶液中，其中V（水相）:V（有機相）=1:1。
改善效果
《一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法》的優點如下：
1）合成四乙醯基-α-D-溴代半乳糖的過程中無需使用有機溶劑，直接將β-D-半乳糖五乙酸酯加入到33%-35%的氫溴酸-醋酸溶液，室溫下反應即可，後處理簡單。
2）4-甲基傘形酮基-2，3，4，6-四乙醯基-β-D-吡喃半乳糖苷存在於有機相中，避免與大量鹼液接觸，減慢反應過程中的分解速度，因而提高了產率。
3）無需使用重金屬鹽，反應所用到的催化劑便宜易得，大大降低了生產成本，且不會產生污染環境的廢液，反應條件溫和，室溫下即可反應。
4）去保護的一步以碳酸鈉為鹼，產率提高到91%。
因此，《一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法》採用相轉移催化（PTC）條件，使溴苷存在於有機相中，從而避免與大量鹼液接觸，減慢了溴苷分解速度，從而提高產率，糖苷化一步產率可達73.1%，反應時間縮短，而且不需使用價格昂貴的重金屬鹽，反應條件溫和。微生物實驗證明，產品和進口底物效果相當，可以替代進口產品。
附圖說明
圖1是4-甲基傘形酮的H NMR譜圖；
圖2是四乙醯基-α-D-溴代半乳糖的H NMR譜圖；
圖3是4-甲基傘形酮基-2，3，4，6-四乙醯基-β-D-吡喃半乳糖苷的H NMR譜圖；
圖4是4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的IR譜圖；
圖5是4-甲基傘形酮基β-D-吡喃半乳糖苷的H NMR譜圖；
圖6是4-甲基傘形酮基β-D-吡喃半乳糖苷的C NMR譜圖。
技術領域
《一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法》屬於半乳糖苷的合成領域，具體涉及一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法。
權利要求
1.一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟：a、4-甲基傘形酮的合成：將間苯二酚和乙醯乙酸乙酯溶解後滴加到濃硫酸中進行反應，反應後將反應液倒入冰水中攪拌，析出固體，過濾重結晶，得到4-甲基傘形酮；b、四乙醯基-α-D-溴代半乳糖的合成：β-D-半乳糖五乙酸酯中加入33%～35%的氫溴酸-醋酸溶液下反應後倒入冰水中，析出固體，過濾並用冰水洗滌，二氯甲烷提取，飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，再飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，濃縮得黃色黏稠狀液體，加入無水乙醚後冷凍結晶，再抽濾得四乙醯基-α-D-溴代半乳糖；c、4-甲基傘形酮基-2，3，4，6-四乙醯基-β-D-吡喃半乳糖苷的合成：4-甲基傘形酮和四丁基溴化銨，溶於氫氧化鈉溶液中；四乙醯基-α-D-溴代半乳糖溶於三氯甲烷中，然後滴加到含有4-甲基傘形酮和四丁基溴化銨的氫氧化鈉溶液中，室溫下反應後，分出有機層，用氫氧化鈉溶液洗滌後無水硫酸鈉乾燥，旋蒸除溶劑得到黃色粘稠液體，矽膠柱層析得4-甲基傘形酮基-2，3，4，6-四乙醯基-β-D-吡喃半乳糖苷；d、4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的合成：4-甲基傘形酮基-2，3，4，6-四乙醯基-β-D-吡喃半乳糖苷溶於甲醇中，與碳酸鈉水溶液反應，然後過濾，冷甲醇洗滌，無水乙醇重結晶，得到4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟a中，所述的將間苯二酚和乙醯乙酸乙酯溶解後滴加到濃硫酸中進行反應，其濃硫酸為體積分數75%濃硫酸，其反應時間為12小時。
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟b中，所述的β-D-半乳糖五乙酸酯中加入33%～35%的氫溴酸-醋酸溶液，其投料比為β-D-半乳糖五乙酸酯:氫溴酸-醋酸溶液=1克:（1.5～2）毫升，反應4小時。
4.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟c中，所述的室溫下反應後，其反應時間為16小時，所述的4-甲基傘形酮、四丁基溴化銨和四乙醯基-α-D-溴代半乳糖的用量的物質的量比為5:3:6，所述的四乙醯基-α-D-溴代半乳糖溶於三氯甲烷中，然後滴加到含有4-甲基傘形酮和四丁基溴化銨的氫氧化鈉溶液中，其中V（水）:V（三氯甲烷）=1:1。
5.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟d中，所述的4-甲基傘形酮基-2，3，4，6-四乙醯基-β-D-吡喃半乳糖苷溶於甲醇中，與碳酸鈉水溶液反應，其反應時間為0.5小時。
實施方式
乙醯乙酸乙酯 | 上海晶純生化科技股份有限公司 |
間苯二酚 | 上海晶純生化科技股份有限公司 |
濃硫酸 | |
無水乙醇 | 廣州化學試劑廠 |
β-D-半乳糖五乙酸酯 | 上海嵐克醫藥有限公司 |
33%-35%HBr/HOAc | 上海達瑞精細化學品有限公司 |
二氯甲烷 | 廣州化學試劑廠 |
碳酸氫鈉 | 廣州化學試劑廠 |
氯化鈉 | 廣州化學試劑廠 |
無水硫酸鈉 | 天津市化學試劑一廠 |
無水乙醚 | 廣州化學試劑廠 |
氫氧化鈉 | 廣州化學試劑廠 |
三氯甲烷 | 廣州化學試劑廠 |
四丁基溴化銨 | 上海晶純生化科技股份有限公司 |
柱層層析矽膠 | 上海晶純生化科技股份有限公司 |
乙酸乙酯 | 廣州化學試劑廠 |
碳酸鈉 | 廣州化學試劑廠 |
甲醇 | 廣州化學試劑廠 |
- 實施例1
稱取5.5克間苯二酚加入到6.5克乙醯乙酸乙酯中，加熱溶化後慢慢滴加到50毫升體積分數75%的濃硫酸中（低於4攝氏度）。滴加完畢，室溫下反應12小時後，將反應液倒入冰水中劇烈攪拌，析出固體，抽濾並用大量冰水洗滌得淡黃色固體。無水乙醇重結晶得4-甲基傘形酮的白色結晶性粉末，產率74.4%。其H NMR譜圖見圖1。H NMR（300MHz，DMSO）δ10.52（s，1H，H-OH），7.59（dd，J=8.7，1.9Hz，1H，H-5），6.80（dd，J=8.7，2.3Hz，1H，H-6），6.71（d，J=2.3Hz，1H，H-8），6.13（s，1H，H-3），2.36（s，3H，CH3）。
稱取5克β-D-半乳糖五乙酸酯中加入33%-35%的氫溴酸-醋酸溶液7.5-10毫升，室溫下反應4小時，將反應液倒入冰水中，析出固體，抽濾並用大量冰水洗滌，二氯甲烷提取，飽和碳酸氫鈉溶液洗滌至中性，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，濃縮得黃色黏稠狀液體。加入無水乙醚後放置在冰櫃（4攝氏度）過夜，析出固體，抽濾得白色固體即為四乙醯基-α-D-溴代半乳糖，產率66.4%。其H NMR見圖2。H NMR（300MHz，CDCl3）δ6.71（d，J=3.9Hz，1H，H-1），5.53（dd，J=3.2，1.1Hz，1H，H-4），5.42（dd，J=10.6，3.3Hz，1H，H-3），5.06（dd，J=10.6，4.0Hz，1H，H-2），4.50（t，1H，H-5），4.16（m，2H，H-6），2.17-2.03（m，12H，OAc）。
稱取0.44克4-甲基傘形酮和0.48克四丁基溴化銨溶於1.25摩爾/升的氫氧化鈉溶液中（2.6毫升）。稱取1.23克四乙醯基-α-D-溴代半乳糖溶15毫升三氯甲烷中，然後緩慢滴加到上述含有4-甲基傘形酮和四丁基溴化銨的氫氧化鈉溶液中，補加水，使水相和有機相體積比為1:1，室溫下反應16小時。反應完畢，靜置分層，有機層用1.25摩爾/升的氫氧化鈉溶液洗滌兩次，無水硫酸鈉乾燥後旋蒸除溶劑，得到黃色粘稠狀液體。矽膠柱層析（石油醚:乙酸乙酯=1.5:1），得白色固體4-甲基傘形酮基-2，3，4，6-四乙醯基-β-D-吡喃半乳糖苷，產率73.1%。其H NMR譜圖見圖3。H NMR（300MHz，DMSO-d6）δ7.74（d，J=8.8Hz，1H，H-5），7.05（d，J=2.4Hz，1H，H-8），6.98（dd，J=8.8，2.5Hz，1H，H-6），6.29（d，J=1.2Hz，1H，H-3），5.66（d，J=7.7Hz，1H，H-1'），5.38–4.52（m，4H，H-2'，3'，4'，5'），4.12（d，J=6.2Hz，2H，H-6'），2.41（d，J=1.1Hz，3H，CH3），2.16（s，3H，OAc），2.05（s，3H，OAc），2.03（s，3H，OAc）1.96（s，3HOAc）。
稱取2.0克4-甲基傘形酮基-2，3，4，6-四乙醯基-β-D-吡喃半乳糖苷溶於60毫升甲醇中，加入碳酸鈉溶液（1.12克溶於20毫升水中），室溫下攪拌反應30分鐘後過濾得白色固體，冷的甲醇洗滌後乙醇重結晶，冷凍乾燥得白色固體（4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷），產率91%。其IR、HNMR和CNMR譜圖見圖4、圖5、圖6。IR（KBr），ν，cm：3452，3218，3084，1699，1613，1512，1425，1387，1280，1068，1029，891.6.H NMR（300MHz，DMSO-d6）δ7.70（d，J=8.7Hz，1H，H-5），7.03（d，J=7.5Hz，2H，H-8，6），6.25（s，1H，H-3），5.26（d，J=4.9Hz，1H，H-OH），4.99（d，J=7.5Hz，1H，H-1'），4.93（d，J=5.7Hz，1H，H-OH）4.69（t，J=5.1Hz，1H，H-OH），4.56（d，J=4.2Hz，1H，H-OH），3.70–3.45（m，6H，H-2'，3'，4'，5'，6'），2.40（s，3H，CH3）.C NMR（75MHz，DMSO-d6）δ160.66（2-C），160.57（7-C），154.81（3-C），153.76（9-C），126.81（5-C），114.41（10-C），113.86（6-C）.112.07（3-C），103.55（8-C），101.03（1'-C），76.15（2'-C），73.66（5'-C），70.57（3'-C），68.60（4'-C），60.86（6'-C），18.58（-CH3）。
該實施例製備的4-甲基傘形酮基β-D-吡喃半乳糖苷的HNMR譜圖、CNMR譜圖和IR譜圖見圖4，圖5和圖6。H NMR譜圖中糖環C1-H的耦合常數為7.5赫茲，根據J1a-2a=7～10赫茲，J1e-2a=2.5～3.5赫茲的規律，可斷定產物為β構型，C NMR可區別β-糖苷和α-糖苷，β-糖苷的端基碳在較低場出峰（100-120百萬分比濃度），而α-糖苷則在高場出峰（<95百萬分比濃度），產物的C1在101.34百萬分比濃度出峰，也可以斷定產物為β構型。另外紅外譜圖中β-型異構體的C1-H的彎曲震動吸收在890厘米-1處出峰，產物在891.6厘米-1處有吸收峰，進一步證實了產物的糖苷鍵為β構型。
- 實施例2 4-甲基傘形酮基β-D-吡喃半乳糖苷套用於大腸菌群檢測
實驗材料及來源
1.標準品4-甲基傘形酮-β-D-吡喃半乳糖苷購自APOLLO科技有限公司。
3.大腸埃希菌Escherichia coli ATCC25922、弗氏檸檬酸桿菌Citrobacter freundii ATCC8090、產氣腸桿菌Enterobacter aerogenes CMCC45103、肺炎克雷伯菌Klebsiella pheumoniae ATCC10031、普通變形桿菌Proteus vuigaris CMCC49027、糞鏈球菌Enterococcus faecalis ATCC29212、福氏志賀菌Shigella flexneri CMCC51572、鼠傷寒沙門氏菌Salmonella trphimurium ATCC14028均購自廣東環凱微生物科技有限公司，實驗用樣品均購自超市。
一、純菌檢測
1）菌種：
將實驗用菌種接種於營養肉湯，37攝氏度培養24小時，即可套用於後續試驗。
2）培養基配置：
稱取22.52克胰酪蛋白腖、5克氯化鈉、2.75克無水磷酸二氫鉀、2.75無水磷酸氫二鉀、0.6克十二烷基硫酸鈉以及MUGal（4-甲基傘形酮-β-D-吡喃半乳糖苷）0.06克溶於1000毫升水中，加熱使溶化，冷卻到50攝氏度左右時調節pH至7.1，分裝試管，每管10毫升，116攝氏度高壓滅菌10分鐘。待培養基冷卻後，每管培養液內加入500微克/毫升的頭孢磺啶稀釋液0.1毫升。APOLLO科技有限公司所產的MUGal也按相同方法製備肉湯（作為對照）。
將培養好的菌種分別轉接兩管自產MUGal（實施例1製備的MUGal）肉湯和兩管進口MUGal肉湯中，接種後置於37攝氏度下培養，18-24小時後紫外燈365納米下觀察產螢光情況。
實驗結果如表1所示：
表1自製MUGal肉湯和APOLLO產MUGal肉湯產螢光比較 
“+”表示產螢光，“—”表示不產螢光
相關腸道菌在《一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法》製備的MUGal和APOLLO產MUGal配成的肉湯中產螢光情況是一致的。
二、實際樣品檢測
從超市購買豬肉、基圍蝦、草魚、涼拌菜、西紅柿、餃子、金針菇、鴨肉、黃瓜、凍雞翅共十份樣品。無菌操作下稱取25克樣品，加入到225毫升無菌生理鹽水中，以8000轉/分-10000轉/分均質1分鐘-2分鐘。按照MPN方法製成十倍遞增的稀釋樣品，選取合適的3個稀釋度接種到《一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法》製備的MUGal肉湯、APOLLO產MUGal肉湯，每個稀釋度各接種3管，每管接種1毫升，37±1攝氏度下培養24小時，檢查並記錄兩種MUGal肉湯產螢光情況。
用《一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法》製備的MUGal肉湯和APOLLO產MUGal肉湯以MPN法平行對比檢測肉製品、速凍食品和新鮮蔬菜等十份樣品。檢測結果見表2。兩組數據經X2檢驗分析，無顯著性差異。《一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法》製備的MUGal和APOLLO產MUGal效果無差異。
表2自製MUGal和APOLLO產MUGal檢驗樣品結果比較
榮譽表彰
2018年12月20日，《一種4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷的製備方法》獲得第二十屆中國專利優秀獎。
