《一種防治白菜菌核病的生物藥劑》是延邊大學於2017年6月7日申請的專利，該專利的公布號為CN107006525A，授權公布日為2017年8月4日，發明人李范洙、張先、李鉉軍、李敏、崔曉宇、付長雪、劉芳芳。該發明涉及殺菌劑技術領域
《一種防治白菜菌核病的生物藥劑》包括以下體積份的組分：33.3～66.7份秸稈熱解液和66.7～33.3份殼聚糖。或者包括33.3～75體積份秸稈熱解液和66.7～25體積份芽孢桿菌發酵液。該生物藥劑對白菜菌核病菌具有顯著抑菌作用，可有效防治白菜菌核菌以及其引起的病害，是一種無毒無殘留的生物藥劑。
2019年10月，《一種防治白菜菌核病的生物藥劑》獲得第三屆吉林省專利獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種防治白菜菌核病的生物藥劑
- 別名：一種防治白菜菌核病的藥劑
- 申請人：延邊大學
- 申請日：2017年6月7日
- 申請號：2017104207828
- 公布號：CN107006525A
- 公布日：2017年6月7日
- 發明人：李范洙、張先、李鉉軍、李敏、崔曉宇、付長雪、劉芳芳
- 地址：吉林省延邊朝鮮族自治州延吉市公園路977號
- Int.Cl.：A01N65/00(2009.01)I、A01N43/16(2006.01)I、A01N63/02(2006.01)I、A01P3/00(2006.01)I
- 代理機構：北京高沃律師事務所
- 代理人：劉奇
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,權利要求,實施方式,操作內容,實施案例,榮譽表彰,
專利背景
隨著氣候的溫暖化，北方白菜栽培區遇到高溫多濕氣候時嚴重發生病害，白菜菌核病是其中之一。菌核菌感染白菜成株，多在地表的莖、葉柄上出現水浸狀淡褐色凹陷病斑，葉片病斑不凹陷，引起葉球或莖基部腐爛，病部密生白色棉毛狀菌絲和散生黑色鼠糞狀菌核，腐爛處無臭味。幼苗發病，在近地面的莖基部產生水浸狀病斑，很快腐爛或猝倒，並不產生明顯的白黴。種株發病，種莢表面產生一層白色棉絮狀菌絲體，莢內生出白色菌絲和黑色菌核，是種株結莢降低，籽粒不飽滿，從而影響種子的產量和品質。莖腐爛後，破裂成亂麻狀，中空，有白色絲狀物後期生有黑色菌核，菌核鼠糞狀，圓形或不規則形，早期白色，以後外部變為黑色，內部白色。如果，商品白菜地受菌核菌侵染，幼苗莖基部腐爛造成缺苗，白菜結球期受害，莖基部腐爛或葉片、葉柄受害，商品性下降，一般減產5～15％。種苗地受菌核菌病害，直接導致菜種株枯死或阻斷養分和水的輸送，造成籽粒乾癟或無籽，一般減產5～20％，嚴重地塊達50％以上。
2017年前，為了防治白菜菌核病一般採用農業防治和化學防治。其中，化學防治包括種子處理、土壤處理和藥劑防治。藥劑防治在發病初期噴灑50％速克靈可濕性粉劑2000倍液，或50％撲海因可濕性粉劑1500倍液，或50％農利靈可濕性粉劑1000倍液，或40％多·硫懸浮劑500-600倍液，或50％甲基硫菌靈500倍液或20％甲基立枯磷乳劑1000倍液。
但是，上述對白菜菌核病的化學防治製劑，雖然低毒，但會在結球白菜中殘留，危害人體安全，有待開發無毒、無殘留的抗白菜菌核菌製劑。
發明內容
專利目的
為了解決白菜菌核病防治過程中化學防治帶來的農藥殘留及危害人體健康的問題，《一種防治白菜菌核病的生物藥劑》選用食品級的原料製備一種無毒無殘留的生物藥劑，該生物藥劑對白菜菌核病菌具有顯著抑菌作用，可有效防治白菜菌核菌以及其引起的病害。
技術方案
《一種防治白菜菌核病的生物藥劑》包括以下體積份的組分：33.3～66.7份秸稈熱解液和66.7～33.3份殼聚糖水溶液，所述殼聚糖水溶液的濃度為0.1～20克/升。
優選的，所述秸稈熱解液包括以下製備步驟：將秸稈粉碎後在450～550℃進行熱解獲得生物油；將所述生物油與水攪拌混合靜置後，將得到的水相部分進行常壓蒸餾，收集95～120℃的蒸餾液，即為秸稈熱解液。更優選的，所述秸稈熱解液還包括稀釋倍數為10～400倍的秸稈熱解液稀釋液。
該發明還提供了另外一種防治白菜菌核病的生物藥劑，包括以下體積份的組分：33.3～75份秸稈熱解液和66.7～25份芽孢桿菌發酵液，所述芽孢桿菌發酵液為芽孢桿菌培養液經離心過濾後得到的無菌濾液。其中，所述芽孢桿菌為甲基型芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、類芽孢桿菌和地衣形芽孢桿菌中的一種或幾種。其中，所述秸稈熱解液包括以下步驟製備而成：將秸稈粉碎後在450～550℃進行熱解獲得生物油；將所述生物油與水攪拌混合靜置後，將得到的水相部分進行常壓蒸餾，收集95～120℃的蒸餾液，即為秸稈熱解液。
優選的，所述秸稈熱解液還包括稀釋倍數為10～400倍的秸稈熱解液稀釋液。優選的，每升生物藥劑中還包括10～500克微量元素。更優選的，所述微量元素為Zn、Mg、Cu、B、Fe和Mn中的一種或幾種。
改善效果
《一種防治白菜菌核病的生物藥劑》與2017年6月之前的技術相比，該發明具有以下優點：該發明選用秸稈快速熱解液和殼聚糖、芽孢桿菌發酵液，分別以秸稈熱解液和殼聚糖、秸稈熱解液和芽孢桿菌發酵液按科學配方復配，開發出專治白菜菌核病的生物藥劑。經過研究發現，這種生物藥劑對菌核菌引起的白菜腐爛病具有顯著抑菌、殺菌作用。該發明的生物藥劑所採用的原料為食品級，除了對白菜菌核病有較好防治效果外，還能克服白菜菌核病防治過程中化學防治帶來的農藥殘留及危害人體健康的問題，為一種安全有效的生物型藥劑。
權利要求
1.《一種防治白菜菌核病的生物藥劑》其特徵在於，包括以下體積份的組分：33.3～66.7份秸稈熱解液和66.7～33.3份殼聚糖水溶液，所述殼聚糖水溶液的濃度為0.1～20克/升。
2.根據權利要求1所述防治白菜菌核病的生物藥劑，其特徵在於，所述秸稈熱解液包括以下製備步驟：將秸稈粉碎之後在450～550℃進行熱解獲得生物油；將所述生物油與水攪拌混合靜置後，將得到的水相部分進行常壓蒸餾，收集95～120℃的蒸餾液，即為秸稈熱解液。
3.根據權利要求2所述防治白菜菌核病的生物藥劑，其特徵在於，所述秸稈熱解液還包括稀釋倍數為10～400倍的秸稈熱解液稀釋液。
4.一種防治白菜菌核病的生物藥劑，其特徵在於，包括以下體積份的組分：33.3～75份秸稈熱解液和66.7～25份芽孢桿菌發酵液，所述芽孢桿菌發酵液為芽孢桿菌培養液經離心過濾後得到的無菌濾液。
5.根據權利要求4所述防治白菜菌核病的生物藥劑，其特徵在於，所述芽孢桿菌為甲基型芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、類芽孢桿菌和地衣形芽孢桿菌中的一種或幾種。
6.根據權利要求4所述防治白菜菌核病的生物藥劑，其特徵在於，所述秸稈熱解液包括以下步驟製備而成：將秸稈粉碎後在450～550℃進行熱解獲得生物油；將所述生物油與水攪拌混合靜置後，將得到的水相部分進行常壓蒸餾，收集95～120℃的蒸餾液，即為秸稈熱解液。
7.根據權利要求4所述防治白菜菌核病的生物藥劑，其特徵在於，所述秸稈熱解液還包括稀釋倍數為10～400倍的秸稈熱解液稀釋液。
8.根據權利要求4所述防治白菜菌核病的生物藥劑，其特徵在於，每升生物藥劑中還包括10～500克微量元素。
9.根據權利要求8所述防治白菜菌核病的生物藥劑，其特徵在於，所述微量元素為Zn、Mg、Cu、B、Fe和Mn中的一種或幾種。
實施方式
操作內容
《一種防治白菜菌核病的生物藥劑》中所用的秸稈熱解液為秸稈經中溫快速熱解後，經過精製而成的熱解液。具體地，該發明的秸稈熱解液包括以下製備步驟：將秸稈粉碎後進行熱解獲得生物油；該發明對秸稈的種類沒有特殊限制，可以採用玉米秸稈、玉米芯、稻草、稻殼、大豆秸稈等農作物秸稈中的一種或幾種。該發明對秸稈粉碎的粒度範圍是50～120目，優選為60～100目，更優選為70～80目。該發明熱解所選用的熱解溫度為450℃～550℃，優選為495℃～505℃；熱解時間優選為1～10s，更優選為3～5s。將秸稈熱解後得到的所述生物油進行分離精製後得到秸稈熱解液。具體地，將所述生物油與水攪拌混合，優選生物油與水混合的體積比為1～3:1～3，進一步優選為1:1～2。得到的混合物經靜置後，將得到的上層水相部分進行常壓蒸餾，收集95℃～120℃，優選為100℃～105℃的蒸餾液，即為秸稈熱解液。經分析得知，製備得到的秸稈熱解液含有有機酸類、酚類、醛類、醇類等物質，對白菜菌核菌有顯著的抑制和殺菌效果。
該發明的秸稈熱解液還包括將秸稈熱解液以一定倍數稀釋的稀釋液。隨熱解液稀釋倍數的增加，其對白菜菌核菌的抑菌作用逐漸減弱，且各稀釋倍數熱解液之間抑菌率差異顯著（p＜0.05），稀釋倍數為30時，秸稈熱解液對白菜菌核病菌抑菌率達100％，病菌不生長；稀釋倍數小於70時，秸稈熱解液對白菜菌核病菌抑菌率高於0.1％醋酸，且差異顯著（p＜0.05）。通過秸稈熱解液稀釋倍數對數值和對應的抑菌幾率值得出秸稈熱解液對菌核菌的毒力回歸方程為y＝-13.875x+44.717x-30.119，相關係數R＝0.9995。通過回歸方程計算出秸稈熱解液對菌核菌EC50值為稀釋70倍。
熱解液稀釋倍數 | 菌落生長面積（平方毫米） | 抑菌率（%） |
30 | - | 100 |
40 | 813.98±47.66 | 81.71±0.01 |
50 | 1250.31±82.17 | 71.35±0.02 |
60 | 1292.01±133.80 | 70.71±0.03 |
70 | 1774.01±171.00 | 49.35±0.04 |
80 | 2698.49±87.92 | 38.34±0.02 |
90 | 3221.58±281.09 | 27.18±0.06 |
100 | 3840.87±281.65 | 21.04±0.06 |
CK | 4364.1±219.67 | - |
0.1%醋酸 | 2453.93±179.00 | 56.23±0.04 |
秸稈熱解液對白菜菌核病菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度見表2。秸稈熱解液稀釋33倍以上時，試管內均有菌絲生長，在稀釋33倍及以下的試管中，無菌絲生長，以試管內無菌絲生長的最小濃度為MIC，由此確定稀釋33倍為秸稈熱解液對白菜菌核病菌的最小抑菌濃度。最小抑菌濃度實驗後從無菌絲生長的試管（30倍、33倍）中將菌餅取出接種在PDA培養基中培養，進一步確定秸稈熱解液對白菜菌核病菌的MFC為稀釋30倍。
秸稈熱解液稀釋倍數 | |||||||||||||
/ | 30 | 33 | 36 | 39 | 42 | 45 | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 | 100 | CK |
菌落生長情況 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
註：試管內有菌絲生長用“+”表示，無菌絲生長用“-”表示，下同。
該發明的殼聚糖溶液對白菜菌核菌的抑菌作用見表3，殼聚糖溶液濃度由0.1克/升成倍增加到5.0克/升時，其對白菜菌核病菌抑菌率由27.97％增加到86.86％，除5.0克/升和4.0克/升殼聚糖溶液處理組抑菌率無顯著差異外，其他各組抑菌率均差異顯著（p＜0.05）。根據殼聚糖溶液濃度和對應的抑菌率求得殼聚糖溶液對白菜菌核病菌的毒力回歸方程為y＝0.6859x-10.826x+22.195，R＝0.9423。通過毒力回歸方程求得殼聚糖溶液對白菜菌核病菌的EC50值為1.4克/升。
殼聚糖溶液濃度（克/升） | 菌絲生長面積（平方毫米） | 抑菌率（%） |
5.0 | 252.78±45.97 | 86.86±0.03 |
4.0 | 258.86±37.90 | 86.52±0.02 |
3.0 | 496.33±70.81 | 73.14±0.04 |
2.0 | 860.55±96.26 | 52.62±0.05 |
1.0 | 886.60± 133.50 | 51.15±0.07 |
0.5 | 1055.95±162.07 | 41.61 ±0.08 |
0.1 | 1310.15±134.83 | 27.29±0.07 |
CK | 1794.45±177.66 | - |
從表4可以看出，殼聚糖溶液濃度為5克/升以下時，試管中有菌絲生長，殼聚糖溶液濃度5克/升開始，試管中無菌絲生長，以無菌絲生長的最低濃度作為殼聚糖溶液對白菜菌核病菌的最小抑菌濃度，即殼聚糖溶液對白菜菌核病菌的MIC為5克/升。不同濃度的殼聚糖溶液所對應的平板中均有菌絲生長，說明殼聚糖溶液對白菜菌核病菌僅有抑制作用，無殺菌作用。
殼聚糖溶液濃度（克/升） | ||||||||
/ | 20 | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | 0.3125 | CK |
菌落生長情況 | - | - | - | + | + | + | + | + |
該發明將秸稈熱解液與殼聚糖溶液進行復配，製備成一種防治白菜菌核病的生物藥劑，包括以下體積份的組分：33.3～66.7份秸稈熱解液和66.7～33.3份殼聚糖溶液。優選的，所述秸稈熱解液為40～60體積份，更優選為45～54體積份。該發明中，殼聚糖溶液的體積份優選為61～38體積份，更優選為52～43體積份。所述殼聚糖溶液的濃度為0.1～20克/升，優選為1～15克/升，更優選為5～10克/升。
殼聚糖的抗菌效果在pH6.5的時候最強，pH在4.5～6.5時，雖然抗菌性較強，但是溶液中存在大量的H和-NH在細菌表面產生競爭性吸附，而pH值在6.5～8.0時，殼聚糖的溶解度差，並且-NH上的質子被中和，抗菌效果減弱。秸稈熱解液pH值為2.0～3.0，上述復配比例正好適合殼聚糖抗菌較強時pH值範圍。而且，該發明的秸稈熱解液還富含有烷基、羧基、羧甲基、醛基、羥基、酮基、醯基等有利於殼聚糖的烷基化、羧甲基化、酯化，產生殼聚糖衍生物如烷基殼聚糖衍生物、羧甲基殼聚糖衍生物、殼聚糖的酯衍生物的生成。這些殼聚糖衍生物都具有較強的抗菌、抑菌作用和效果。因此，該發明的秸稈熱解液和殼聚糖復配其抑菌效果比兩種單獨使用的抑菌效果更好，作用更強。
該發明中，秸稈熱解液還包括以一定倍數稀釋的秸稈熱解液稀釋液。優選秸稈熱解液的稀釋倍數為10～400倍，更優選為20～200倍，進一步優選為30～150倍。該發明對殼聚糖的來源沒有特殊限定，採用市售產品即可。
該發明還提供了另外一種防治白菜菌核病的生物藥劑，將秸稈熱解液與芽孢桿菌發酵液進行一定比例的復配，對白菜菌核菌有良好的抑制作用。其中，秸稈熱解液為上述製備方法製備得到，在此不再贅述。所述芽孢桿菌發酵液為芽孢桿菌培養液經離心過濾後得到的無菌濾液。其中，芽孢桿菌培養液為含有芽孢桿菌和芽孢桿菌生長發酵所需培養液的混合液。所述培養液為該領域中芽孢桿菌的常規培養液，具體的，所述培養液為LB液體培養基。
該發明的芽孢桿菌發酵液是將芽孢桿菌菌懸液進行發酵培養經離心過濾後得到的無菌濾液。所述芽孢桿菌菌懸液可以採用該領域的常規方法進行培養。具體的，芽孢桿菌菌懸液是用無菌接種環刮取少量已活化的芽孢桿菌菌種於100毫升 LB液體培養基中，32℃恆溫搖床培養24小時，製成濃度不少於3.75×10個/毫升的菌懸液。取2毫升芽孢桿菌菌懸液接種到200毫升 LB液體培養基中，於32℃、160轉/分鐘條件下振盪培養5天，菌液經10000轉/分鐘離心15分鐘，取上清液用0.2微米微孔濾膜過濾而得到的無菌濾液。該發明的芽孢桿菌菌懸液中含有芽孢桿菌的濃度為4.0×10～3.0×10，優選為1.0×10～4.0×10個/毫升，更優選為3.5×10～4.0×10個/毫升。
該發明中所述的芽孢桿菌為從大豆蒸煮、搗碎、造型之後自然發酵而得到的大醬中分離出的對白菜菌核菌具有拮抗作用的菌株。大醬中分離得到的拮抗芽孢桿菌對白菜菌核菌具有抑菌作用，其作用於白菜菌核菌會使白菜菌核菌菌絲的原生質濃縮，部分細胞顏色加深，芽管變短變粗，不易分枝節出現畸形，菌絲體邊緣扭曲，部分出現消解的現象，最終死亡。該發明從大醬中分離得到的芽孢桿菌菌株為甲基型芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、類芽孢桿菌和地衣形芽孢桿菌中的一種或幾種。
菌株名稱及編號 | 菌落面積（平方毫米） | 抑菌率（%） |
CK | 5680.97 | - |
枯草芽孢桿菌（SP-7） | 1054.43 | 60.47 |
甲基型芽孢桿菌（SP-8） | 1109.21 | 59.30 |
類芽孢桿菌（SP-17） | 1035.53 | 60.89 |
地衣形芽孢桿菌 KACC15833 | 752.93 | 67.57 |
註：CK為對照，即加等量無菌水而不加菌株發酵液的培養基。
該發明芽孢桿菌的抑菌活性受到pH的影響，當pH值在6.0的時候大醬中分離得到的芽孢桿菌菌絲生長最旺盛，且抑菌作用也最強。該發明秸稈熱解液的原液pH值在2.0～3.0，將33.3～75體積份秸稈熱解液和66.7～25體積份芽孢桿菌發酵液進行復配後，其pH值範圍在5.5～6.5，適合於拮抗芽孢桿菌抑菌效果最強時候的pH值範圍。因此，該發明防治白菜菌核病的生物藥劑，為包括33.3～75體積份秸稈熱解液和66.7～25體積份芽孢桿菌發酵液。該發明中，秸稈熱解液優選添加25～75體積份，進一步優選為33.3～75體積份。該發明中芽孢桿菌發酵液優選添加75～25體積份，進一步優選為75～33.3體積份。該發明將秸稈熱解液和大醬中分離得到的拮抗芽孢桿菌進行復配，其抑菌效果比兩種單獨使用的抑菌效果更好。
該發明中，秸稈熱解液還包括以一定倍數稀釋的秸稈熱解液稀釋液。優選秸稈熱解液的稀釋倍數為10～400倍，更優選為20～200倍，進一步優選為30～150倍。
該發明含有芽孢桿菌發酵液的生物藥劑中，每升優選還含有10～500克的微量元素，所述微量元素為Zn、Mg、Cu、B、Fe和Mn中的一種或幾種。
所述微量元素-秸稈熱解液混合液製備工藝，包括以下步驟：
（1）將秸稈熱解液加熱至70～80℃。
（2）將微量元素Zn、Mg、Cu、B、Fe和Mn中的一種或幾種化合物按照重量比分別稱取10～500克，溶解於1升的秸稈熱解液當中，邊攪拌製成微量元素-秸稈熱解液混合溶液。
（3）將微量元素-秸稈熱解液混合溶液冷卻至5～25℃，低溫偶合處理15～30天。
實施案例
實施例1
將稻草粉碎至70目後在500℃進行熱解3s獲得生物油；將得到的生物油與水按體積比為1:2攪拌混合，靜置後，將上層水相部分進行常壓蒸餾，收集100℃的蒸餾液，即為秸稈熱解液。
將得到的秸稈熱解液稀釋70倍，與1.4克/升的殼聚糖水溶液按照33.3:66.6（V/V）混合得到防治白菜菌核病的生物藥劑。
實施例2
將玉米秸稈粉碎至75目後在550℃進行熱解5s獲得生物油；將得到的生物油與水按體積比為1:1攪拌混合，靜置後，將上層水相部分進行常壓蒸餾，收集105℃的蒸餾液，即為秸稈熱解液。
將得到的秸稈熱解液稀釋70倍，與10克/升的殼聚糖水溶液按照50:50（V/V）混合得到防治白菜菌核病的生物藥劑。
實施例3
將大豆秸稈粉碎至80目後在450℃進行熱解4s獲得生物油；將得到的生物油與水按體積比為1:2攪拌混合，靜置後，將上層水相部分進行常壓蒸餾，收集120℃的蒸餾液，即為秸稈熱解液。
將得到的秸稈熱解液稀釋70倍，與20克/升的殼聚糖水溶液按照66.6:33.3（V/V）混合得到防治白菜菌核病的生物藥劑。
實施例 | 菌絲生長面積 (平方毫米) | 實際抑菌率 (%) | 理論抑菌率 (%) | 共毒因子 |
實施例1 | 572.14 | 89.40 | 44.32 | 101.71 |
實施例2 | 345.56 | 93.75 | 41.57 | 125.52 |
實施例3 | 400.94 | 92.69 | 49.54 | 87.10 |
CK | 5233.33 | - | - | - |
實施例4
將稻草粉碎至70目後在500℃進行熱解3s獲得生物油；將得到的生物油與水按體積比為1:2攪拌混合，靜置後，將上層水相部分進行常壓蒸餾，收集100℃的蒸餾液，即為秸稈熱解液。
將從大醬中分離得到的甲基型芽孢桿菌拮抗菌株接種於LB培養液中，在32℃恆溫搖床培養箱內培養24小時，含有甲基型芽孢桿菌菌落總數為3.75×10個/毫升的芽孢桿菌菌懸液。然後取2毫升甲基型芽孢桿菌菌懸液接種到200毫升 LB液體培養基中於32℃、160轉/分鐘條件下振盪培養5天，菌液經10000轉/分鐘離心15分鐘，取上清液用0.2微米微孔濾膜過濾，得到無菌的甲基型芽孢桿菌發酵液。
將秸稈熱解液稀釋70倍，與上述芽孢桿菌發酵液以分別以50:50（V/V）混合得到防治白菜菌核病的生物藥劑。
實施例4 | 菌絲生長面積（平方毫米） | 抑菌率（％） |
重複1 | 845.05 | 60.37 |
重複2 | 809.38 | 61.37 |
重複3 | 847.63 | 60.30 |
CK | 4435.67 | - |
實施例5
將玉米秸稈粉碎至85目後在500℃進行熱解3s獲得生物油；將得到的生物油與水按體積比為1:1攪拌混合，靜置後，將上層水相部分進行常壓蒸餾，收集100℃的蒸餾液，即為秸稈熱解液。
將從大醬中分離得到的類芽孢桿菌拮抗菌株接種於LB培養液中，在32℃恆溫搖床培養箱內培養24小時，含有類芽孢桿菌菌落總數為3.75×10個/毫升的芽孢桿菌菌懸液。然後取2毫升類芽孢桿菌菌懸液接種到200毫升 LB液體培養基中於32℃、160轉/分鐘條件下振盪培養5天，菌液經10000轉/分鐘離心15分鐘，取上清液用0.2微米微孔濾膜過濾，得到無菌的類芽孢桿菌發酵液。
將秸稈熱解液稀釋70倍，與上述芽孢桿菌發酵液以30:60（V/V）混合得到防治白菜菌核病的生物藥劑。
實施例5 | 菌絲生長面積（平方毫米） | 抑菌率（%） |
重複1 | 327.97 | 80.95 |
重複2 | 342.89 | 80.38 |
重複3 | 303.11 | 81.92 |
CK | 5812.61 | - |
實施例6
將大豆秸稈粉碎至75目後在550℃進行熱解4s獲得生物油；將得到的生物油與水按體積比為1:2攪拌混合，靜置後，將上層水相部分進行常壓蒸餾，收集110℃的蒸餾液，即為秸稈熱解液。
將從大醬中分離得到的枯草芽孢桿菌拮抗菌株接種於LB培養液中，在32℃恆溫搖床培養箱內培養24小時，含有枯草芽孢桿菌菌落總數為3.75×10個/毫升的芽孢桿菌菌懸液。然後取2毫升枯草芽孢桿菌菌懸液接種到200毫升 LB液體培養基中於32℃、160轉/分鐘條件下振盪培養5天，菌液經10000轉/分鐘離心15分鐘，取上清液用0.2微米微孔濾膜過濾，得到無菌的枯草芽孢桿菌發酵液。
將秸稈熱解液稀釋70倍，與上述芽孢桿菌發酵液以60:30（V/V）混合得到防治白菜菌核病的生物藥劑。
實施例6 | 菌絲生長面積（平方毫米） | 抑菌率（%） |
重複1 | 1102.14 | 59.48 |
重複2 | 1056.16 | 60.47 |
重複3 | 1169.01 | 58.09 |
CK | 5690.32 | - |
實施例7
將大豆秸稈粉碎至65目後在550℃進行熱解4s獲得生物油；將得到的生物油與水按體積比為1:2攪拌混合，靜置後，將上層水相部分進行常壓蒸餾，收集110℃的蒸餾液，即為秸稈熱解液。
將從大醬中分離得到的枯草芽孢桿菌拮抗菌株接種於LB培養液中，在32℃恆溫搖床培養箱內培養24小時，含有枯草芽孢桿菌菌落總數為3.75×10個/毫升的芽孢桿菌菌懸液。然後取2毫升枯草芽孢桿菌菌懸液接種到200毫升 LB液體培養基中於32℃、160轉/分鐘條件下振盪培養5天，菌液經10000轉/分鐘離心15分鐘，取上清液用0.2微米微孔濾膜過濾，得到無菌的枯草芽孢桿菌發酵液。
將秸稈熱解液加熱至70～80℃。將微量元素Zn、Mg、Cu、B、Fe和Mn中的化合物按照等比例分別稱取50克，溶解於1升的秸稈熱解液當中，攪拌後製成微量元素-秸稈熱解液混合溶液。將微量元素-秸稈熱解液混合溶液冷卻至5～25℃，低溫偶合處理15～30天。再與上述芽孢桿菌發酵液以60:30（V/V）混合得到防治白菜菌核病的生物藥劑。
實施例7 | 菌絲生長面積（平方毫米） | 抑菌率（%） |
重複1 | 894.69 | 60.87 |
重複2 | 943.03 | 59.65 |
重複3 | 998.79 | 58.28 |
CK | 4838.60 | - |
榮譽表彰
2019年10月，《一種防治白菜菌核病的生物藥劑》獲得第三屆吉林省專利獎優秀獎。
