《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》是北京大學第三醫院、敖英芳於2011年1月19日申請的專利，該專利申請號為2011100214948，公布號為CN102078642A，公布日為2011年6月1日，發明人是敖英芳、張辛、何震明、馬勇、周春燕。
《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》公開了一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法，屬於醫用材料領域。該支架的材料為脫鈣松質-皮質骨，脫鈣松質-皮質骨上設有貫穿脫鈣松質骨和脫鈣皮質骨的小孔。小孔垂直於脫鈣皮質骨水平表面設定，小孔的直徑為0.1~1毫米。小孔為兩個以上，小孔的孔中心距為0.5~5毫米。該發明提供的製備方法，將骨骼浸泡於脫鈣液中進行脫鈣處理；用原子吸收分光光度計監測脫鈣進程；脫鈣後的標本進行X線和CT檢測，以證明骨骼完全脫鈣，得到脫鈣松質-皮質骨；在脫鈣皮質骨水平表面以0.1~1毫米的直徑雷射打孔；將脫鈣皮質骨剪裁成一定的大小規格，冷凍貯存。該發明採用的天然膠原支架材料，無免疫排斥反應，易於細胞吸附，生物相容性好，併兼有良好的機械強度。
2021年6月24日，《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》獲得第二十二屆中國專利金獎。
（概述圖為《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名： 一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法
- 類別：發明專利
- 公布號：CN102078642A
- 公布日：2011年6月1日
- 申請號：2011100214948
- 申請日：2011年1月19日
- 申請人： 北京大學第三醫院、敖英芳
- 發明人： 敖英芳、張辛、何震明、馬勇、周春燕
- 地址：北京市海淀區花園北路49號
- Int. Cl.：A61L27/36(2006.01)I; A61L27/56(2006.01)I
- 代理機構：北京三高永信智慧財產權代理有限責任公司
- 代理人：孟阿妮
專利背景,發明內容,發明目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,操作內容,實施案例,專利榮譽,
專利背景
關節軟骨損傷是運動醫學領域的難治性損傷。運動引起的關節軟骨損傷發生率很高，北京大學運動醫學研究所的調查結果顯示軟骨損傷占膝關節運動創傷的40.5％以上。軟骨損傷後常會引起關節腫痛等症狀。由於軟骨組織結構特殊，其內無神經、血管和淋巴管，軟骨的營養供給是通過關節活動產生的壓力變化，使滑液在關節腔與軟骨基質之間進行交流，故損傷後的關節軟骨不能修復與再生，且易導致明顯的功能障礙。中國國內、中國國外軟骨修複方法很多，但是尚無一種公認的完善修複方法。截至2011年1月，利用自身骨髓修復軟骨缺損，如：軟骨下骨微骨折技術成為了軟骨缺損修復的重要方法之一。由於它操作簡單，對於小面積的軟骨缺損取得良好結果，在臨床軟骨修復上已經廣泛套用。但由於微骨折是通過骨髓形成的瘢塊填充缺損，瘢塊的機械應力太低，無法承受關節活動產生的壓力。因此微骨折術後較長時間6周不能負重；修復位置可能出現塌陷或過度增生；微骨折方法對於大面積和非水平位置的軟骨微骨折效果並不理想，而且新生軟骨多為纖維軟骨。因此，尋找適合的軟骨缺損填充支架也成為軟骨修復的主要研究方向之一。
截至2011年1月使用的軟骨修復支架材料可大體分為天然支架材料和人工支架材料兩大類。天然支架材料是來源於動、植物或者人體內天然存在的大分子材料，具有良好的生物相容性、組織親合性。人工支架材料是截至2011年1月研究較多的材料，主要有聚羥基乙酸、聚乳酸、以及聚酸酐等，可根據需要調整其物理、化學、生物力學和降解性能，容易加工成形，生產重複性好。
在實現《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》的過程中，發明人發現既往技術至少存在以下問題：天然支架材料存在材料性質無法改變，機械強度及降解速度難於控制等問題。常用的天然支架材料有膠原蛋白、羥基磷灰石等，天然支架生物力學性質難以調整，很難找到和軟骨生物力學性質相似的。有些天然生物材料支架的機械力學差，無法抵抗關節運動時產生的機械應力，容易造成修補處的塌陷，也同時影響材料上細胞的生長，而如羥基磷灰石支架彈性和蠕變性較軟骨差，硬度過高易造成相對應的軟骨關節面的磨損。人工支架材料的生物相容性相對較差，存在不同程度的炎性反應，以及免疫原性問題，甚至致癌性問題。
發明內容
發明目的
《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》的目的是針對上述技術的缺陷，提供一種兼有良好的生物相容性和機械強度的關節軟骨修復再生用支架；另一個目的是提供關節軟骨修復再生用支架的製備方法。
技術方案
為了實現發明目的，《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》採取的技術方案是：所述支架的材料為脫鈣松質-皮質骨，所述脫鈣松質-皮質骨上設有貫穿脫鈣松質骨和脫鈣皮質骨的小孔。所述小孔垂直於所述的脫鈣皮質骨水平表面設定，所述小孔的直徑為0.1~1毫米。所述小孔為兩個以上，相鄰所述小孔的中心距離為0.5~5毫米。所述小孔的孔隙率為5％~50％。
該發明提供的另一個技術方案是：一種關節軟骨修復再生用支架的製備方法，包括以下步驟：（1）選擇包括皮質骨和松質骨雙層結構的骨骼；（2）將所述骨骼浸泡於脫鈣液中進行脫鈣處理；（3）用原子吸收分光光度計監測脫鈣進程；（4）脫鈣後的標本進行X線和CT檢測，當骨骼完全脫鈣後，得到脫鈣松質-皮質骨；（5）垂直於脫鈣皮質骨水平表面以0.1~1毫米的直徑雷射打孔，鑽孔貫穿脫鈣皮質骨和脫鈣松質骨兩層，穿透整個支架；（6）將脫鈣松質-皮質骨剪裁成使用需要的規格，冷凍貯存。所述脫鈣液為0.1M~0.7M乙二胺四乙酸，pH值6~10，溫度：2~10攝氏度。
進一步地，在移植所述生物支架前，所述生物支架進行鈷60照射12~72小時。所述骨骼為低溫冷凍的人髂骨、椎體骨或長骨幹骺端。
改善效果
《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》實施例提供的技術方案帶來的有益效果是：
1、運用成熟的商業骨庫中的人骨為原料，骨庫骨是已經通過藥監局批准，並套用於臨床多年的原料，供體來源充分且安全，易於臨床普及。很多動物松質-皮質骨（牛、羊等）脫鈣經該發明的方法處理也可以用於人軟骨損傷的修復。牛、羊養殖數量多，取骨做材料更為廣泛。
2、該發明運用了保護脫鈣骨支架生物特性脫鈣新方法，同時解決了用乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣所存在的問題。普遍運用的酸（鹽酸、硝酸和甲酸等）脫鈣方法，對骨的膠原支架損傷很大，造成支架變脆，彈性模量下降等生物學和生物力學性質的改變，無法再用於軟骨修復。該發明中運用EDTA（中性鈣離子螯合劑）（此種中性脫鈣劑對骨膠原支架損傷最小）進行人骨的脫鈣。但由於EDTA脫鈣劑只能滲透人皮質骨表面2毫米，無法完全脫去皮質骨中心的鈣質，而且時間過長，無法滿足臨床套用需要。因此該發明放棄單純脫鈣皮質骨支架而選用皮質-松質骨，支架中皮質骨厚度只取0.1~1毫米，其餘用松質骨的厚度補足缺損深度，由於松質骨的多孔隙結構，使脫鈣液很容易進入材料中心。不僅能完全脫鈣，而且顯著縮短了脫鈣時間，滿足臨床套用。
3、利用材料中的薄層皮質骨，可以運用固定釘將修復材料固定於軟骨缺損處，增加軟骨修復支架的牢固程度，縮短病人術後負重行走、恢復運動功能的時間。
4、支架中松質骨的疏鬆多孔結構，可以容納更多軟骨下骨釋放的骨髓及骨髓來源幹細胞，有更加寬闊的空間讓骨髓幹細胞進行粘附、遷移和營養物質的交換，加速幹細胞的增殖和分化，軟骨缺損的修復。
5、該發明採用的天然膠原支架材料，無免疫排斥反應的問題，易於細胞吸附，生物相容性好。
6、在脫鈣松質-皮質骨支架自身富含骨形態蛋白（BMPs），可促進誘導支架中的骨髓中間的幹細胞或骨髓基質細胞轉化成軟骨細胞或骨細胞，促進幹細胞分泌、軟骨或骨基質的分泌。對軟骨修復的啟動、發育、調控及塑形均有重要作用。
7、操作簡便，不需二次手術，節省了手術中取材時間，易於臨床套用。該發明的縱向鑽孔的脫鈣松質-皮質骨關節軟骨再生用支架，使用時利用微骨折技術釋放自身的骨髓幹細胞，使其通過支架上的縱向鑽孔擴散至脫鈣松質骨支架內部，脫鈣松質骨支架支撐自體骨髓幹細胞三維立體生長，同時支架上的骨形態蛋白（BMPs）誘導骨髓幹細胞向骨、軟骨生長、分化。該發明避開了組織工程中體外支架培養細胞，外源因子誘導，生成物回植等複雜的步驟，無需二次手術，更適用於臨床套用。
附圖說明
圖1是《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》實施例提供的關節軟骨修復再生用支架示意圖；
圖2是圖1的剖視圖；
圖3是《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》實施例提供的關節軟骨修復再生用支架的製備流程圖；
圖4是《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》實施例提供的關節軟骨修復再生用支架掃描電鏡結構圖；
圖5是《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》實施例提供的人脫鈣皮質-松質骨支架修復膝關節軟骨缺損手術圖；
圖6是《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》實施例提供的人脫鈣皮質-松質骨支架修復膝關節軟骨缺損後12周取材觀察膝關節軟骨缺損修復處大體圖；
圖7是《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》實施例提供的人脫鈣皮質-松質骨支架修復膝關節軟骨缺損12周HE染色圖；
圖8是《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》實施例提供的人脫鈣皮質-松質骨支架修復膝關節軟骨缺損12周甲苯胺藍軟骨特異性染色圖；
圖9是《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》實施例提供的人脫鈣皮質-松質骨支架修復膝關節軟骨缺損12周II型膠原免疫組化染色圖。
技術領域
《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》涉及醫用材料領域，特別涉及一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法。
權利要求
1.一種關節軟骨修復再生用支架，其特徵在於，所述支架的材料為脫鈣松質-皮質骨，所述脫鈣松質-皮質骨上設有貫穿脫鈣松質骨和脫鈣皮質骨的小孔；所述小孔是在垂直於脫鈣皮質骨水平表面通過雷射打孔，鑽孔貫穿所述脫鈣皮質骨和所述脫鈣松質骨兩層，穿透整個支架而製得。
2.根據權利要求1所述的支架，其特徵在於，所述小孔垂直於所述脫鈣皮質骨水平表面設定，所述小孔的直徑為0.1~1毫米。
3.根據權利要求2所述的支架，其特徵在於，所述小孔為兩個以上，相鄰所述小孔的中心距離為0.5~5毫米。
4.根據權利要求1所述的支架，其特徵在於，所述小孔的孔隙率為5%~50%。
5.一種關節軟骨修復再生用支架的製備方法，包括以下步驟：
（1）選擇包括皮質骨和松質骨雙層結構的骨骼，所述骨骼為低溫冷凍的人髂骨、椎體骨或長骨幹骺端；
（2）將所述骨骼浸泡於脫鈣液中進行脫鈣處理，所述脫鈣液為0.1M~0.7M乙二胺四乙酸，pH值6~10，溫度：2~10攝氏度；
（3）用原子吸收分光光度計監測脫鈣進程；
（4）脫鈣後的標本進行X線和CT檢測，當骨骼完全脫鈣後，得到脫鈣松質-皮質骨；
（5）垂直於脫鈣皮質骨水平表面以0.1~1毫米的直徑雷射打孔，鑽孔貫穿脫鈣皮質骨和脫鈣松質骨兩層，穿透整個支架；
（6）將脫鈣松質-皮質骨剪裁成使用需要的規格，冷凍貯存；在移植所述生物支架前，所述生物支架進行鈷60照射12~72小時。
實施方式
操作內容
為使《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》的目的、技術方案和優點更加清楚，下面結合附圖對該發明實施方式作進一步地詳細描述。
參見圖1和圖2，一種關節軟骨修復再生用支架，所述支架的材料為脫鈣松質-皮質骨，脫鈣皮質骨1連線著脫鈣松質骨3，所述脫鈣松質-皮質骨上設有貫穿脫鈣松質骨3和脫鈣皮質骨1的小孔2。
作為一種優選，小孔2垂直於脫鈣皮質骨1水平表面設定，小孔2的直徑為0.1~1毫米，可以為0.1毫米、0.5毫米、1毫米。小孔2為兩個以上，相鄰小孔2的孔中心的距離為0.5~5毫米，孔中心距離可以為0.5毫米、1.2毫米、3.4毫米、5毫米。小孔2的孔隙率為5％~20％，支架總體厚度大於2毫米。
實施案例
- 實施例1
參見圖3，一種關節軟骨修復再生用支架的製備方法，包括以下步驟：
步驟101：選擇皮質骨下帶有松質骨的骨骼，將皮質骨厚度修整在0.5~3毫米，脫鈣液為0.1M~0.7M乙二胺四乙酸，pH值6~10，溫度：2~10攝氏度；
步驟102：將骨骼浸泡於脫鈣液中進行脫鈣處理；
步驟103：用原子吸收分光光度計監測脫鈣進程；
步驟104：脫鈣後的標本進行x線和CT檢測，以證明骨骼完全脫鈣，得到脫鈣松質-皮質骨；
步驟105：在脫鈣皮質骨水平表面以0.1~1毫米的直徑雷射打孔；
步驟106：通過納米壓痕生物力學測試儀檢測脫鈣松質-皮質骨支架各部分納米彈性模量，篩選出和正常軟骨彈性模量相似的脫鈣松質-皮質骨作為關節軟骨修復再生用支架，將脫鈣松質-皮質骨剪裁成使用需要的規格，冷凍貯存；
步驟107：在移植所述生物支架前，所述生物支架進行鈷60照射12~24小時。
採用本實施例的關節軟骨修復再生用支架的修複方法主要步驟為：
首先，在骨軟骨缺損區域進行刨颳去除纖維變、不規則的病變軟骨和軟骨下骨。繼而，進行軟骨下骨磨削，將骨軟骨缺損修成比較規則的形狀。然後進行軟骨下骨的鑽孔使能夠釋放自身的骨髓。
接著，將雷射鑽孔處理的脫鈣骨支架，修整成符合骨軟骨缺損的形狀，填入缺損處，皮質骨部分為底層。軟骨下骨由於鑽孔而釋放的自身的骨髓，會通過支架皮質骨上的小孔滲透入脫鈣松質骨中，進而修復骨軟骨缺損處。釋放出的自身骨髓幹細胞，增強了修復能力。單純軟骨下骨鑽孔釋放出的自身骨髓，無支架不能承擔應力且無法按照特定結構規範修復，生成的關節軟骨缺乏正常的結構。而採用了該發明的脫鈣骨關節軟骨再生用支架，使釋放的骨髓經過支架中的脫鈣皮質骨孔道滲入脫鈣松質骨中，既增加了修復早期的修補處的機械強度，修補處的機械應力有可按缺損形狀三維立體的調控骨髓修復作用。
- 實施例2
關節軟骨修復再生用支架的製備方法：製備流程圖如圖3所示，購置深低溫凍存人髂骨或椎體骨，浸泡於0.1M~1M EDTA脫鈣液中，脫鈣液的溫度為6攝氏度內，pH為8，利用螯合脫去皮質骨中的鈣，脫鈣液每日更換。用去離子水配製EDTA脫鈣液，用塑膠容器盛載。每日換下的脫鈣液用原子吸收分光光度計檢測鈣離子濃度以監測脫鈣進程，當脫鈣液中的Ca螯合物濃度＜0.5克/升，即為完全脫鈣，脫鈣後的標本進行x線和CT檢測，證明完全脫鈣。由於脫鈣皮質骨表面結構過於緻密，不宜於細胞的長入。因此該發明通過雷射鑽孔技術如圖2所示，將脫鈣皮質骨水平表面以0.5毫米的直徑垂直鑽孔，鑽孔採用雷射鑽孔，（實驗兔動物模型上與臨床病人套用孔徑有所不同，因為人、兔的關節大小不同，所以孔徑和孔距都不同），比較後設定孔間間隔2毫米，然後，如圖3所示，將雷射鑽孔脫鈣松質-皮質骨支架剪裁成一定的大小規格，冷凍貯存。在移植前，製備的雷射鑽孔的脫鈣松質-皮質骨支架進行鈷60照射18小時消毒。
參見圖4，雷射鑽孔脫鈣松質-皮質骨軟骨關節再生用支架松質骨部分的結構掃描電鏡圖。可見脫鈣松質骨中膠原纖維疏鬆交錯排列，膠原纖維間充滿空隙，孔隙結構交錯相通，有利於骨髓基質和因子的滲入及細胞的附著。脫鈣皮質骨天然片層樣，有幾點優勢：（1）膠原結構可對抗鉛垂方向牽引力和壓力，有利於軟骨再生支架固定於軟骨缺損。（2）片層間的間隙有利於骨髓基質和因子的滲入及細胞的附著；有利於細胞營養物質的交換。
- 在動物模型上進行修補軟骨缺損實驗的手術過程
為驗證該發明的關節軟骨修復再生用支架在修補方法中的效果，在動物模型上進行了模擬手術實驗。選擇2.5~3.0千克的紐西蘭大耳白兔，麻醉，備皮，消毒，如圖5所示，切口膝關節露出股骨滑車，在股骨滑車上做4毫米直徑，1.5毫米深的缺損，在軟骨下骨鑽孔微骨折處理後，在已消毒好的雷射鑽孔脫鈣松質-皮質骨支架修成4毫米直徑，高度1.5毫米的圓柱體，填充入缺損。分層縫合傷口，術後12周取材，進行組織學的觀察。
圖6為紐西蘭大耳白兔使用雷射鑽孔脫鈣松質-皮質骨關節軟骨修復再生用支架進行軟骨修復12周后的大體圖。在大體標本上可見箭頭所指的修復處，已呈現軟骨樣改變，和周圍正常組織極為相似，與正常軟骨的交界處已不明顯，未出現縫隙。未見明顯免疫炎症反應。
參見圖7、圖8和圖9的紐西蘭大耳白兔雷射鑽孔脫鈣松質-皮質骨關節軟骨再生用支架進行軟骨修復12周后的組織學切片染色。可見箭頭所指的修復處的脫鈣松質-皮質骨支架已完全被新生的透明軟骨所替代，修復處未出現塌陷，與圖右側的正常軟骨的交界處緊密接合，界線模糊。由於早期觀察軟骨下骨還未被骨替代，呈現軟骨樣組織。未見巨噬細胞等炎症細胞浸潤，未見明顯免疫炎症反應。新生組織HE染色圖如圖7；新生組織甲苯胺藍染色（特異性針對軟骨基質中粘多糖成分）陽性如圖8；新生組織II型膠原免疫組織化學染色陽性如圖9，證明新生組織富含II型膠原為類似正常軟骨組織的透明軟骨。
該發明的雷射鑽孔的脫鈣骨關節軟骨再生用支架是運用同種異體人的脫鈣的皮質骨和松質骨製備的，採用雷射鑽孔的脫鈣松質-皮質骨關節軟骨再生用支架修復時，操作簡便，易於臨床套用。而且使用該發明的關節軟骨修復再生用支架可以解決異體移植排斥反應的缺點，修復時自體骨髓不僅提供自體幹細胞，同時提供細胞生存的微環境，比單純軟骨細胞或幹細胞移植有更高的細胞生存率。該發明方法運用同種異體的脫鈣人骨支架解決人工合成支架的生物相容性問題。通過生物力學測試表明製備的脫鈣骨支架的機械應力和彈性模量更接近於軟骨，解決了蠶絲、膠原蛋白、纖維蛋白、人羊膜等天然生物材料支架機械力學差，無法抵抗關節運動時產生的機械應力的問題。不會造成修補處的塌陷，也同時可支持材料上細胞的生長。而且脫鈣松質-皮質骨關節軟骨再生用支架是使用人的脫鈣松質-皮質骨，本身富含骨形態蛋白（BMPs），可促進誘導支架中的骨髓中間的幹細胞或骨髓基質細胞轉化成軟骨細胞或骨細胞，促進幹細胞分泌軟骨或骨基質的分泌。對軟骨修復的啟動、發育、調控及塑形均有重要作用。
以上所述僅為《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》的較佳實施例，並不用以限制該發明，凡在該發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在該發明的保護範圍之內。
專利榮譽
2021年6月24日，《一種關節軟骨修復再生用支架及其製備方法》獲得第二十二屆中國專利金獎。
