《一種酮還原酶基因及其套用》是江蘇阿爾法藥業有限公司和東南大學於2012年9月6日申請的專利，該專利的公布號為CN102827851A，申請號為2012103274165，授權公布日為2012年12月19日，發明人是陳峻青、蔡進、吉民、石進祥、石利平、尹曉龍，該發明屬於生物技術領域。
《一種酮還原酶基因及其套用》的酮還原酶基因，序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的酮還原酶胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示。一種生產酮還原酶的基因工程菌，其中包含該發明所述的酮還原酶基因。一種酮還原酶的製備方法，包括如下步驟：培養該發明生產酮還原酶的基因工程菌，獲得重組表達的酮還原酶。以該重組表達製備的酮還原酶為催化劑，不對稱還原酮類化合物製備光學活性手性醇，底物轉化率達96.8%，還原產物的ee大於99%。
2015年12月1日，《一種酮還原酶基因及其套用》獲得第九屆江蘇省專利項目優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種酮還原酶基因及其套用
- 公布號：CN102827851A
- 申請號：2012103274165
- 授權日：2012年12月19日
- 申請日：2012年9月6日
- 申請人：江蘇阿爾法藥業有限公司、東南大學
- 地址：江蘇省宿遷市生態化工科技產業園燕山路9號
- 發明人：陳峻青、蔡進、吉民、石進祥、石利平、尹曉龍
- 代理機構：南京天華專利代理有限責任公司
- 類別：發明專利
- 代理人：徐冬濤、傅婷婷
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,保藏信息,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
阿托伐他汀鈣（atorvastatin calcium），商品名立普妥（lipitor），化學名（3R,5R）-7-[2-（4-氟苯基）-5-異丙基-3-苯基-4-（苯氨基甲醯基）吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酸鈣鹽，它能夠強效抑制羥甲基戊二醯單醯輔酶A（HMG-CoA）還原酶的活性，阻斷HMG-CoA還原成羥甲戊酸，進而大大降低總膽固醇和低密度脂蛋白的含量，可有效改善動脈粥樣硬化，降低血液中的脂蛋白濃度，不僅是治療高膽固醇血脂症和混合型高血脂症的首選藥物，還能有效防治冠心病和腦中風等疾病。由於阿托伐他汀鈣具有起效快，降脂作用強，作用時間長等優點，該藥一經推出，就取得了很好的銷售業績。
（3R,5R）-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯（分子式為C（CH3）3OCOCH2CH（OH）CH2CH（OH）CH2CN，分子量為229.27，CAS號：125971-93-9），帶有兩個具有手性結構的羥基，是合成阿托伐他汀鈣的關鍵手性中間體，該部分結構也是HMG-CoA還原酶特異性結合的關鍵部位，其合成方法有多種，常見的方法主要有化學法和生物法兩種。與化學法相比，生物法具有反應條件溫和：常溫、常壓、中性或接近中性pH，設備要求不高，投入資金相對較少，且反應轉化率高、對映體選擇性高等多種優點，更受研究人員和生產企業的青睞。
發明內容
專利目的
《一種酮還原酶基因及其套用》的目的是針對2012年9月前已有技術的上述不足，提供一種酮還原酶基因及其編碼的酮還原酶。該發明的另一目的是提供含有該基因的載體和基因工程菌。該發明的又一目的是提供該酮還原酶基因及其編碼的酮還原酶的套用。
技術方案
一種酮還原酶基因，序列如SEQ ID NO.1所示。
該發明所述的酮還原酶基因編碼的酮還原酶，胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
含有該發明所述的酮還原酶基因的重組表達載體，優選將該發明所述的酮還原酶基因插入到Puc18中所得到的重組表達載體。
一種生產酮還原酶的基因工程菌，其中包含該發明所述的酮還原酶基因。
所述基因工程菌的宿主細胞優選大腸埃希氏菌（Escherichia coli），進一步優選大腸埃希氏菌BL21（DE3）或大腸埃希氏菌Mc1061，最優選保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2012年8月29日，保藏編號為CCTCC M 2012319的基因工程菌BL21（DE3）KRED06。
一種酮還原酶的製備方法，包括如下步驟：培養該發明所述的生產酮還原酶的基因工程菌，獲得重組表達的酮還原酶。
所述的培養包括搖瓶培養或發酵罐培養。
其中發酵培養基成分為：酵母膏20克/升，蛋白腖15克/升，NaCl6克/升，葡萄糖20克/升，磷酸氫二鉀11.5克/升，磷酸二氫鉀6.5克/升，硫酸銨1.0克/升，硫酸鎂七水合物0.6克/升，檸檬酸鐵80毫克/升，硫酸鋅七水合物50毫克/升，氯化銅四水合物20毫克/升，鉬酸銨四水合物50毫克/升。
其中所述發酵罐培養的發酵條件是：DO30%以上，空氣流量1:1.5vvm，葡萄糖殘餘量1%以下。
發酵過程採用常規的兩階段控制策略：發酵前期即菌體生長階段，控制發酵液pH7.0左右，罐溫35-37℃；發酵後期即添加IPTG之後的酮還原酶誘導表達階段，控制發酵液pH7.0-7.2左右，罐溫為28℃。以使發酵前期菌體大量繁殖，發酵後期鹵醇脫鹵酶大量表達。
該發明所述的酮還原酶基因在不對稱還原酮類化合物中的套用，通過基因工程手段構建含有權利要求1所述的酮還原酶基因的基因工程菌，表達製備酮還原酶，以所得的酮還原酶為催化劑，不對稱還原酮類化合物，以製備光學活性手性醇。
其中，所述的酮類化合物結構式為：
其中，R1為烷基，苯基或帶有取代基的苯基，鹵素，CN；
R2為烷基，苯基或帶有取代基的苯基。
反應方程式如下
該發明所述的酮還原酶作為催化劑在不對稱還原酮類化合物中的套用。
所述的套用按下述方法進行：在pH7.0的磷酸鹽緩衝液中，在NADP、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖存在下，在權利要求2所述的酮還原酶作用下，不對稱還原酮類化合物，製得光學手性醇。
所述的酮類化合物結構式為：
其中，R1為烷基，苯基或帶有取代基的苯基，鹵素，CN；
R2為烷基，苯基或帶有取代基的苯基。
反應方程式如下：
有益效果
《一種酮還原酶基因及其套用》以NCBI登錄號為851974的酮還原酶基因為基礎，通過基因突變，獲得一個SEQ ID NO.1所示的新的酮還原酶基因。以該基因構建基因工程菌，結合發酵工藝最佳化，重組表達製備的酮還原酶酶活為792.6U（野生型酮還原酶酶活為96.2U），且發酵過程無需額外添加輔酶。以該重組表達製備的酮還原酶為催化劑，不對稱還原酮類化合物製備光學活性手性醇，底物轉化率達96.8%，還原產物的ee大於99%。
保藏信息
大腸桿菌BL21（DE3）KRED06（Escherichia coli BL21（DE3）KRED06），保藏於位於中國武漢武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2012年8月29日，保藏編號為CCTCC NO：M 2012319。
權利要求
1.一種酮還原酶基因，其特徵在於序列如SEQ ID NO.1所示。
2.權利要求1所述的酮還原酶基因編碼的酮還原酶，其特徵在於胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有權利要求1所述的酮還原酶基因的重組表達載體。
4.一種生產酮還原酶的基因工程菌，其特徵在於所述基因工程菌中包含權利要求1所述的酮還原酶基因。
5.根據權利要求4所述的基因工程菌，其特徵在於所述基因工程菌的宿主細胞為大腸埃希氏菌（Escherichia coli）。
6.根據權利要求5所述的基因工程菌，其特徵在於所述基因工程菌的宿主細胞為大腸埃希氏菌BL21（DE3）或大腸埃希氏菌MC1061。
7.根據權利要求5所述的基因工程菌，其特徵在於所述基因工程菌保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2012年8月29日，保藏編號為CCTCC M 2012319的基因工程菌BL21（DE3）KRED06。
8.一種酮還原酶的製備方法，其特徵在於包括如下步驟：培養權利要求4所述的基因工程菌，獲得重組表達的酮還原酶。
9.根據權利要求8所述的製備方法，其特徵在於所述的培養包括搖瓶培養或發酵罐培養。
10.根據權利要求9所述的製備方法，其中所述發酵罐培養的發酵條件是：D030%以上，空氣流量1:1.5vvm，葡萄糖殘餘量1%以下。
11.權利要求1所述的酮還原酶基因在不對稱還原酮類化合物中的套用，其特徵在於通過基因工程手段構建含有權利要求1所述的酮還原酶基因的基因工程菌，表達製備酮還原酶，以所得的酮還原酶為催化劑，不對稱還原5R-6-氤基-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯,以製備光學活性手性醇。
12.權利要求2所述的酮還原酶作為催化劑在不對稱還原5R-6-氤基-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯中的套用。
13.根據權利要求12所述的套用，其特徵在於，所述的套用按下述方法進行：在pH7.0的磷酸鹽緩衝液中，在NADP+、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖的存在下，在權利要求2所述的酮還原酶作用下，不對稱還原5R-6-氤基-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯，製得光學手性醇。
實施方式
實施例1基因工程菌的建立
通過NCBI查閱酮還原酶的基因（NCBI登錄號為851974）；人工合成酮還原酶基因片段，以該基因片段為模板，通過PCR擴增擴展酮還原酶的基因片段（片段兩端加Hind3和EcoR1內切酶片段），其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；並利用Hind3和EcoR1內切酶位點將基因插入至Puc18質粒中，將連線後載體轉入大腸桿菌BL21（DE3）中建立酮還原酶基因工程菌。其中PCR擴增酮還原酶基因的引物為：正向引物F1：TGCCTGCTACGTTAAAGAA（SEQ ID NO.4），反向引物F2：AAAATTGGGAAGGATCCCCAC（SEQ ID NO.5）。
實施例2酮還原酶突變體基因的獲得
該研究利用易錯PCR隨機突變的方法，對酮還原酶進行了蛋白質工程改造。易錯PCR是在採用DNA聚合酶進行目的基因擴增時，通過調整反應條件，如提高鎂離子濃度、加入錳離子、改變體系中四種的dNTPs濃度或運用低保真度DNA聚合酶等，來改變擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，獲得蛋白質分子的隨機突變體。
該研究採用較低的Taq聚合酶在特定措施下很容易向擴增產物中摻入隨機突變的原理，同時利用Mn替代天然輔助因子Mg增加易錯機率。
100微升PCR體系如下:10×PCR Buffer10微升，dATP（100毫摩爾/升）0.2微升，dGTP（100毫摩爾/升）0.2微升，dCTP（100毫摩爾/升）1微升，dTTP（100毫摩爾/升）1微升，MgCl2（5毫摩爾/升）20微升，MnCl2（0.2毫摩爾/升）1微升，F1Primer（10微摩爾/升）1微升，F2Primer（10微摩爾/升）1微升，大量抽提Puc18-KRED質粒DNA1微升，Taq DNA Polymerase2U，再加入滅菌超純水到100微升。
PCR反應條件為：95℃預變性10分鐘；94℃變性45s，55℃變性45s及72℃變性90s進行30個循環；於72℃下繼續延伸10分鐘，冷卻至4℃。
實驗流程：按照實施例1的方法PCR擴增酮還原酶基因並利用Hind3和EcoR1內切酶位點將基因插入至Puc18質粒中，作為基因突變模板；易錯PCR擴增酮還原酶的基因，擴增後基因片段連結至Puc18-T載體，將連線後載體轉入之大腸桿菌BL21（DE3）中建立酮還原酶基因突變文庫；利用大腸桿菌BL21（DE3）為宿主，Puc18質粒為載體，表達擴展酮還原酶，高通量篩選高活性突變株；突變後高活性酮還原酶基因進行鑑定。篩選出的高活性酮還原酶突變體基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
酮還原酶基因引物為：正向引物F1：TGCCTGCTACGTTAAAGAA（SEQ ID NO.4）
反向引物F2：AAAATTGGGAAGGATCCCCAC（SEQ ID NO.5）
按實施例1所述方法構建表達該酮還原酶突變體的基因工程菌，並將其命名為E.ColiBL21（DE3）KRED06。
實施例3酮還原酶的搖瓶製備
將實施例1或實施例2所得的重組大腸桿菌接種至含卡拉黴素（或氨苄青黴素）的LB培養基（蛋白腖10克/升，酵母膏5克/升，NaCl10克/升，pH7.0）中，於30℃，200轉/分鐘的搖床中振盪培養16小時以上。轉接2毫升菌體培養液於50毫升含卡拉黴素（或氨苄青黴素）的LB培養基中，置於同樣條件下振盪培養，定時測量菌液在600納米下的吸光值以監測菌體生長密度。當菌液的OD600值在0.6-0.8時，加入誘導劑IPTG至終濃度為0.5毫摩爾/升，將培養液置於20℃，200轉/分鐘的搖床中誘導表達10小時。此後通過5000G離心10分鐘收集菌體，經細胞破碎、離心、濃縮、冷凍乾燥等處理得到鹵醇脫鹵酶或鹵醇脫鹵酶突變體的粉末。
實施例4重組酮還原酶和葡萄糖脫氫酶活力的測定
通過檢測反應過程中340納米處NADPH吸光值的變化計算酮還原酶的活力。酮還原酶活力測定方法為：於1毫升反應體系（50毫摩爾，pH8.0Tris-HCl緩衝液）中，加入0.2毫摩爾NADPH，0.3毫摩爾5R-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯，30℃保溫2分鐘後，加入實施例3製備的50微升重組酮還原酶，迅速混勻，檢測340納米處吸光度的變化。每單位酶活定義為在上述條件下，每分鐘催化氧化0.1毫摩爾NADPH所需的酶量。
據此測定野生型酮還原酶的酶活為96.2U，實施例3製備的酮還原酶突變體的酶活為364.9U。
葡萄糖脫氫酶活力測定方法：於1毫升反應體系（100毫摩爾磷酸鈉緩衝溶液中，pH7.0）中，加入10毫摩爾/升葡萄糖，1毫摩爾/升NADP，30℃保溫2分鐘後加入適量葡萄糖脫氫酶粗酶液（自製），迅速混勻，檢測340納米處吸光度的變化。每單位酶活定義為在上述條件下，每分鐘催化還原0.1毫摩爾NADP所需的酶量。
實施例5重組酮還原酶的發酵生產
發酵培養基成分為：酵母膏20克/升，蛋白腖15克/升，NaCl6克/升，葡萄糖20克/升，磷酸氫二鉀11.5克/升，磷酸二氫鉀6.5克/升，硫酸銨1.0克/升，硫酸鎂七水合物0.6克/升，檸檬酸鐵80毫克/升，硫酸鋅七水合物50毫克/升，氯化銅四水合物20毫克/升，鉬酸銨四水合物50毫克/升。發酵液pH7.0，攪拌轉速800轉/分鐘左右，發酵過程中控制DO30%以上，空氣流量1:1.5vvm，葡萄糖殘餘量1%以下。接入種子液的OD600為1.2，接入量為發酵液體積的5%，發酵前期即菌體生長階段，控制發酵液pH7.0左右，罐溫35-37℃，發酵液OD600達50時加入IPTG至終濃度1毫摩爾/升以誘導酮還原酶的表達，控制發酵液pH7.0-7.2左右，罐溫為28℃左右，此後繼續發酵15小時。發酵過程中當葡萄糖濃度低於10克/升時，通過流加含葡萄糖300克/升、氯化銨12克/升、硫酸鋅七水合物50毫克/升、氯化銅四水合物20毫克/升、鉬酸銨四水合物50毫克/升、檸檬酸鐵80毫克/升，pH7.0的溶液維持培養物的生長。發酵結束後將培養物冷卻至4℃保存。
將保存的發酵液經6000G離心40分鐘、細胞破碎、冷凍乾燥等常規處理，製備得到鹵醇脫鹵酶凍乾粉並於-80℃保存。測得酮還原酶突變體酶活為792.6U。
實施例6重組酮還原酶催化5R-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯的不對稱還原
在5000升反應釜中，加入5R-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯的水溶液（氰基含量1.95千摩爾），NADPNa220千克，葡萄糖脫氫酶（1×10U）12.8千克，葡萄糖60千克，異丙醇50升，期間始終控制溫度在30℃以下，並用硫酸調節溶液的pH值至5.0-6.0，之後向釜內投加實施例5方法製備的重組酮還原酶凍乾粉（1×10U）12.8千克，攪拌反應38小時。至底物含量降至1%以下時終止反應。反應終止後經脫色、離心、萃取等操作，得到產物（3R，5R）-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯（H-NMR（CDCl3,400MHz/ppm）；1.47（9H,s）,1.72（2H,dd）,2.43（2H,dd）,2.55（2H,dd）,3.96（1H,dd）,4.21（1H,bt）,4.23-4.34（1H,m）,4.25（1H,bs）；C-NMR（CDCl3,100MHz/ppm）；25.8,28.1,40.8,41.9,67.9,68.7,82.1,117.4,172.1）。經氣相色譜分析，確定底物轉化率96.8%，還原產物的ee99.5%。
產物ee值的具體分析條件為：色譜柱為CP-Chirasil-DEXCB手性毛細管柱，FID檢測器。色譜柱溫度120℃，氣化和檢測溫度均為280℃，載氣為N2。
榮譽表彰
2015年12月1日，《一種酮還原酶基因及其套用》獲得第九屆江蘇省專利項目優秀獎。
