《一種脾多肽注射液的製備方法》是深圳市艾民醫藥科技有限公司於2015年11月24日申請的專利，該專利的公布號為CN105342996A，授權公布日為2016年2月24日，發明人是王靜。該發明屬於生物製劑領域。
《一種脾多肽注射液的製備方法》的方法包括勻漿、超聲提取、調節pH值、反覆凍融、離心、乙醇沉澱、調節pH值、加熱、冷卻、過濾、冷凍、融化等步驟。與2015年11月之前的技術相比，該發明採用超聲提取，並結合乙醇沉澱的方法大大提高了脾多肽的提取率，從而得到的脾多肽提取物中多肽的含量高，其臨床療效好。
2019年10月，《一種脾多肽注射液的製備方法》獲得第三屆吉林省專利獎金獎。
基本介紹
- 中文名：一種脾多肽注射液的製備方法
- 申請人：深圳市艾民醫藥科技有限公司
- 申請日：2015年11月24日
- 申請號：2015108249197
- 公布號：CN105342996A
- 公布日：2016年2月24日
- 發明人：王靜
- 地址：廣東省深圳市福田區華強北街道深南路佳和華強大廈A座1501-1503-72
- Int.Cl.：A61K9/08(2006.01)I、A61K38/02(2006.01)I、A61K35/26(2015.01)I
- 代理機構：北京元中智慧財產權代理有限責任公司
- 代理人：另婧
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
而脾臟是哺乳動物的外周免疫器官，也是動物體內代謝最為旺盛的器官之一，由於其中含有豐富的細胞基本營養成分及細胞因子，特別是促進細胞代謝的活性成分如多肽類物質和核酸以及免疫調節因子——寡核苷肽等，因而受到研究者的廣泛關注。中國國外對脾提取物的研究工作較早，2015年前已有用於化妝品的商品，如crydermine及增強免疫功能的保健品，如spleenP.M.G、IM-Encap、Gold-speen500等。
《肉類工藝》2002年2期的“豬脾多肽的製備工藝研究”公開了豬脾臟的製備工藝，工藝流程為脾臟——去脂肪——勻漿——脫脂——酶解——終止反應——過濾——吸附脫色——凝膠層析——真空乾燥——成品。具體工藝為：取一定量的新鮮豬脾臟，取掉大塊的外表脂肪、表皮及皮下筋膜，加1:1的10℃蒸餾水，用組織搗碎機勻漿，按4:1的比例加正己烷或乙醚在常溫下密閉抽提2h脫脂，分離得到脫脂的脾臟勻漿；將400毫升脾勻漿液，置於恆溫水浴鍋中，調節溫度至（50±2）℃，以Ca（OH）2乳液調節溶液至酶最適pH值，加入30g酶，反應一段時間後，以1:1HCl調pH至中性，同時升溫至80℃保持15分鐘，使酶鈍化中止反應，紗布過濾，濾液加5％的活性炭吸附脫色，抽濾，過G-15葡聚糖凝膠柱，收集範圍的溶液，50℃真空濃縮乾燥，得脾臟多肽成品。該工藝採用的是酶解法，通過酶解脾臟中蛋白質來獲得多肽，所得多肽成分組成易變動且並非原來天然存在的多肽。
CN1634987A公開了一種從除人以外的哺乳動物脾臟組織中提取製備的脾多肽提取物，將哺乳動物組織經去脂肪、勻漿、調酸、凍融破碎、調節pH值沉澱、加熱、離心過濾、超濾等步驟製得脾多肽提取物；該藥為免疫調節藥，能夠提高和改善機體免疫功能，可用於原發性和繼發性細胞免疫缺陷病（如濕疹、血小板減少、多次感染綜合症等）、呼吸道及肺部感染、習慣性感冒、慢性B型肝炎、流行性腮腺炎、復發性口瘡等疾病治療，可在治療放化療引起的白細胞減少症、白血病、再生性障礙貧血、淋巴瘤及其他惡性腫瘤、改善腫瘤患者惡變質、改善術後或重症患者身體虛弱時輔助使用。
然而，採用2015年11月之前的技術的方法提取率低，使得脾多肽提取物中多肽的含量低，從而影響其製劑的療效。有鑒於此，特提出該發明。
發明內容
專利目的
《一種脾多肽注射液的製備方法》的目的在於提供一種脾多肽注射液的製備方法，該方法脾多肽提取率高，得到的提取物中多肽的含量高，療效好。
技術方案
《一種脾多肽注射液的製備方法》該方法包括如下步驟：
1）取新鮮健康乾淨的除人以外的哺乳動物的脾臟，加水勻漿，得勻漿液；
2）將勻漿液進行超聲提取，得提取液；
3）提取液調節pH值至3.8～4.2，反覆凍融2～3次；最後一次融化後的提取液離心，取上清液過濾，得清液I；
4）向清液I中加入95％乙醇，攪拌，使清液I中乙醇含量在75～85％，0～10℃靜置12～24小時，濾取上清液，得清液II；
5）清液II調節pH值至6.5～7.0，加熱，冷卻至常溫後離心，取上清液過濾，得清液III；
6）清液III冷凍，凍實後融化，過濾，清液超濾1～2次，所得超濾液即為脾多肽提取物；
7）上述脾多肽提取物過濾至配置罐中，補加注射用水定容，並調節pH值至6.5～7.0，經終端過濾後灌裝，滅菌，包裝，即得所述的脾多肽注射液。
CN1634987A公開了一種從除人以外的哺乳動物脾臟組織中提取製備的脾多肽提取物及製備方法，然而該方法的提取率低，使得脾多肽提取物中多肽的含量低，從而影響其製劑的療效。該發明對脾多肽的提取方法進行了改進，試驗表明，採用該發明方法脾多肽的提取率高，得到的脾多肽提取物中多肽的含量高，其臨床療效好。
其中，步驟1）中，加水的量為脾臟重量的6～10倍，優選8倍。即加水的質量與脾臟重量的比為6:1～10:1，優選8:1。液料比即所加的水的質量與脾臟重量的比。液料比不同對提取率有一定的影響。該發明在提取溫度為55℃、超聲功率為70瓦、提取時間為12分鐘時，考察了不同液料比對提取率的影響，如圖1所示。由圖1可知，開始隨著液料比增大，脾多肽提取率增加，當液料比為6:1～10:1時，脾多肽提取率大於50％；而當液料比大於8：1以後，則出現降低的趨勢。因此，該發明中選擇液料比為6:1～10:1，優選8:1。
步驟2）中，所述的超聲提取為在溫度50～60℃、超聲功率60～80瓦的條件下超聲提取8～16分鐘；優選所述的超聲提取為在溫度55℃、超聲功率70瓦的條件下超聲提取12分鐘。提取溫度、超聲功率和提取時間對提取率有著較大的影響該發明在液料比為8:1、超聲功率為70瓦、提取時間為12分鐘時，考察了不同提取溫度對提取率的影響，如圖2所示。由圖2可知，在一定範圍內脾多肽的提取率隨溫度升高而增加，當提取溫度為50～60℃時，脾多肽提取率大於50％；當提取溫度為55℃時提取率達到最大，此後，溫度上升提取率反而呈下降趨勢。因此，該發明中選擇提取溫度為50～60℃，優選55℃。
同時，該發明在液料比為8:1、提取溫度為55℃、提取時間為12分鐘時，考察了不同超聲功率對提取率的影響，如圖3所示。由圖3可知，隨超聲功率的增加，脾多肽提取率隨之提高，當提取功率為60～80瓦時，脾多肽提取率大於50％；當提取功率為70瓦時提取率達到最大，此後，超聲功率增加提取率反而呈下降趨勢。因此，該發明中選擇提取功率為60～80瓦，優選70瓦。
該發明還在液料比為8:1、超聲功率為70瓦、提取溫度為55℃時，考察了不同提取時間對提取率的影響，如圖4所示。由圖4可知，隨著提取時間的延長，脾多肽提取率隨之提高，當提取時間為8～16分鐘時，脾多肽提取率大於50％；當提取時間為12分鐘時提取率達到最大，超過12分鐘後，提取率呈減少趨勢。因此，該發明中選擇提取時間為8～16分鐘，優選12分鐘。
步驟3）中，所述的凍融為在-18～-22℃下冷凍，在15～22℃下融化。
步驟3）和步驟5）中所述離心的條件為3500～4000轉/分，離心時間15～20分鐘。
優選的，步驟5）中，所述的加熱為在75～80℃下加熱15～20分鐘。
優選的，步驟6）中，所述的冷凍為在-18～-22℃下冷凍，所述的融化為在10～15℃下融化。
優選的，步驟6）中，所述的超濾用截留分子量6000道爾頓以下的超濾膜超濾。
該發明所述的哺乳動物可為豬、狗、牛、羊、鹿、馬或兔等。從豬、狗、牛、羊、鹿、馬或兔等新鮮健康脾臟組織中均可提取該發明所述的活性多肽。從生產成本、生產工藝、產品質量穩定性、臨床療效等因素考慮，上述哺乳動物脾臟組織優選牛脾臟組織作為脾多肽提取物的生產原料。
改善效果
與2015年11月之前的技術相比，《一種脾多肽注射液的製備方法》具有如下優點：採用該發明的方法脾多肽的提取率高，得到的脾多肽提取物中多肽的含量高，其臨床療效好。
附圖說明
圖1為液料比對提取率的影響示意圖；
圖2為提取溫度對提取率的影響示意圖；
圖3為超聲功率對提取率的影響示意圖；
圖4為提取時間對提取率的影響示意圖。
權利要求
1.《一種脾多肽注射液的製備方法》其特徵在於，所述的製備方法包括如下步驟：
1）取新鮮健康乾淨的除人以外的哺乳動物的脾臟，加水勻漿，得勻漿液；
2）將勻漿液進行超聲提取，得提取液；
3）提取液調節pH值至3.8～4.2，反覆凍融2～3次；最後一次融化後的提取液離心，取上清液過濾，得清液I；
4）向清液I中加入95％乙醇，攪拌，使清液I中乙醇含量在75～85％，0～10℃靜置12～24小時，濾取上清液，得清液II；
5）清液II調節pH值至6.5～7.0，加熱，冷卻至常溫後離心，取上清液過濾，得清液III；
6）清液III冷凍，凍實後融化，過濾，清液超濾1～2次，所得超濾液即為脾多肽提取物；
7）上述脾多肽提取物過濾至配置罐中，補加注射用水定容，並調節pH值至6.5～7.0，經終端過濾後灌裝，滅菌，包裝，即得所述的脾多肽注射液。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟1）中，加水的量為脾臟重量的6～10倍。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，加水的量為脾臟重量的8倍。
4.根據權利要求2或3所述的製備方法，其特徵在於，步驟2）中，所述的超聲提取為在溫度50～60℃、超聲功率60～80瓦的條件下超聲提取8～16分鐘。
5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述的超聲提取為在溫度55℃、超聲功率70瓦的條件下超聲提取12分鐘。
6.根據權利要求1～5任意一項所述的製備方法，其特徵在於，步驟3）中，所述的凍融為在-18～-22℃下冷凍，在15～22℃下融化。
7.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，步驟3）和步驟5）中所述離心的條件為3500～4000轉/分，離心時間15～20分鐘。
8.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，步驟5）中，所述的加熱為在75～80℃下加熱15～20分鐘。
9.根據權利要求1～8任意一項所述的製備方法，其特徵在於，步驟6）中，所述的冷凍為在-18～-22℃下冷凍，所述的融化為在10～15℃下融化。
10.根據權利要求9所述的製備方法，其特徵在於，步驟6）中，所述的超濾用截留分子量6000道爾頓以下的超濾膜超濾。
實施方式
實施例1
1）取新鮮健康的牛脾臟10千克，剔除雜質及脂肪組織，得到乾淨的脾臟，加8倍脾臟重量的水勻漿，得勻漿液；
2）將勻漿液進行超聲提取，得提取液，其中，所述的超聲提取為在溫度55℃、超聲功率70瓦的條件下超聲提取12分鐘；
3）提取液調節pH值至4.0，在-20℃下冷凍，在18℃下融化，反覆凍融2次；最後一次融化後的提取液離心，離心條件為3800轉/分，離心時間18分鐘，取上清液過濾，得清液I；
4）向清液I中加入95％乙醇，攪拌，使清液I中乙醇含量在80％，5℃靜置18小時，濾取上清液，得清液II；
5）清液II調節pH值至6.8，在78℃下加熱18分鐘，冷卻至常溫後離心，離心條件為3800轉/分，離心時間18分鐘，取上清液過濾，得清液III；
6）清液III在-20℃下冷凍，凍實後在12℃下融化，過濾，清液用截留分子量6000道爾頓以下的超濾膜超濾2次，所得超濾液即為脾多肽提取物，分子量小於6000，多肽含量為12毫克/毫升；
7）取1000毫升上述脾多肽提取物，過濾至配置罐中，補加注射用水定容至2升，並調節pH值至6.8，經終端過濾後灌裝，製成2毫升/支的小容量注射劑，100℃滅菌30分鐘，包裝入庫，即得所述的脾多肽注射液，每毫升含有多肽6毫克/毫升。
實施例2
1）取新鮮健康的豬脾臟10千克，剔除雜質及脂肪組織，得到乾淨的脾臟，加6倍脾臟重量的水勻漿，得勻漿液；
2）將勻漿液進行超聲提取，得提取液，其中，所述的超聲提取為在溫度50℃、超聲功率60瓦的條件下超聲提取8分鐘；
3）提取液調節pH值至3.8，在-18℃下冷凍，在15℃下融化，反覆凍融2次；最後一次融化後的提取液離心，離心條件為3500轉/分，離心時間15分鐘，取上清液過濾，得清液I；
4）向清液I中加入95％乙醇，攪拌，使清液I中乙醇含量在75％，0℃靜置12小時，濾取上清液，得清液II；
5）清液II調節pH值至6.5，在75℃下加熱15分鐘，冷卻至常溫後離心，離心條件為3500轉/分，離心時間15分鐘，取上清液過濾，得清液III；
6）清液III在-18℃下冷凍，凍實後在10℃下融化，過濾，清液用截留分子量6000道爾頓以下的超濾膜超濾1次，所得超濾液即為脾多肽提取物，分子量小於6000，多肽含量為11.8毫克/毫升；
7）取1000毫升上述脾多肽提取物，過濾至配置罐中，補加注射用水定容至2升，並調節pH值至6.5，經終端過濾後灌裝，製成5毫升/支的小容量注射劑，100℃滅菌30分鐘，包裝入庫，即得所述的脾多肽注射液，每毫升含有多肽5.9毫克/毫升。
實施例3
1）取新鮮健康的羊脾臟10千克，剔除雜質及脂肪組織，得到乾淨的脾臟，加10倍脾臟重量的水勻漿，得勻漿液；
2）將勻漿液進行超聲提取，得提取液，其中，所述的超聲提取為在溫度60℃、超聲功率80瓦的條件下超聲提取16分鐘；
3）提取液調節pH值至4.2，在-22℃下冷凍，在22℃下融化，反覆凍融3次；最後一次融化後的提取液離心，離心條件為4000轉/分，離心時間20分鐘，取上清液過濾，得清液I；
4）向清液I中加入95％乙醇，攪拌，使清液I中乙醇含量在85％，10℃靜置24小時，濾取上清液，得清液II；
5）清液II調節pH值至7.0，在80℃下加熱20分鐘，冷卻至常溫後離心，離心條件為4000轉/分，離心時間20分鐘，取上清液過濾，得清液III；
6）清液III在-22℃下冷凍，凍實後在15℃下融化，過濾，清液用截留分子量6000道爾頓以下的超濾膜超濾2次，所得超濾液即為脾多肽提取物，分子量小於6000，多肽含量為11.6毫克/毫升；
7）取1000毫升上述脾多肽提取物,過濾至配置罐中，補加注射用水定容至2升，並調節pH值至7.0，經終端過濾後灌裝，製成10毫升/支的小容量注射劑，100℃滅菌30分鐘，包裝入庫，即得所述的脾多肽注射液，每毫升含有多肽5.8毫克/毫升。
實施例4
1）取新鮮健康的豬脾臟10千克，剔除雜質及脂肪組織，得到乾淨的脾臟，加7倍脾臟重量的水勻漿，得勻漿液；
2）將勻漿液進行超聲提取，得提取液，其中，所述的超聲提取為在溫度58℃、超聲功率65瓦的條件下超聲提取10分鐘；
3）提取液調節pH值至4.0，在-20℃下冷凍，在18℃下融化，反覆凍融2次；最後一次融化後的提取液離心，離心條件為3800轉/分，離心時間18分鐘，取上清液過濾，得清液I；
4）向清液I中加入95％乙醇，攪拌，使清液I中乙醇含量在80％，5℃靜置20小時，濾取上清液，得清液II；
5）清液II調節pH值至6.8，在78℃下加熱18分鐘，冷卻至常溫後離心，離心條件為3800轉/分，離心時間18分鐘，取上清液過濾，得清液III；
6）清液III在-20℃下冷凍，凍實後在12℃下融化，過濾，清液用截留分子量6000道爾頓以下的超濾膜超濾2次，所得超濾液即為脾多肽提取物，分子量小於6000，多肽含量為11.8毫克/毫升；
7）取1000毫升上述脾多肽提取物，過濾至配置罐中，補加注射用水定容至2升，並調節pH值至6.8，經終端過濾後灌裝，製成5毫升/支的小容量注射劑，100℃滅菌30分鐘，包裝入庫，即得所述的脾多肽注射液，每毫升含有多肽5.9毫克/毫升。
實施例5
1）取新鮮健康的馬脾臟10千克，剔除雜質及脂肪組織，得到乾淨的脾臟，加9倍脾臟重量的水勻漿，得勻漿液；
2）將勻漿液進行超聲提取，得提取液，其中，所述的超聲提取為在溫度52℃、超聲功率65瓦的條件下超聲提取10分鐘；
3）提取液調節pH值至3.9，在-19℃下冷凍，在20℃下融化，反覆凍融3次；最後一次融化後的提取液離心，離心條件為3750轉/分，離心時間16分鐘，取上清液過濾，得清液I；
4）向清液I中加入95％乙醇，攪拌，使清液I中乙醇含量在80％，6℃靜置18小時，濾取上清液，得清液II；
5）清液II調節pH值至7.0，在76℃下加熱17分鐘，冷卻至常溫後離心，離心條件為3750轉/分，離心時間17分鐘，取上清液過濾，得清液III；
6）清液III在-21℃下冷凍，凍實後在13℃下融化，過濾，清液用截留分子量6000道爾頓以下的超濾膜超濾2次，所得超濾液即為脾多肽提取物，分子量小於6000，多肽含量為12毫克/毫升；
7）取1000毫升上述脾多肽提取物，過濾至配置罐中，補加注射用水定容至2升，並調節pH值至7.0，經終端過濾後灌裝，製成5毫升/支的小容量注射劑，100℃滅菌30分鐘，包裝入庫，即得所述的脾多肽注射液，每毫升含有多肽6毫克/毫升。
實施例6
1）取新鮮健康的狗脾臟10千克，剔除雜質及脂肪組織，得到乾淨的脾臟，加9倍脾臟重量的水勻漿，得勻漿液；
2）將勻漿液進行超聲提取，得提取液，其中，所述的超聲提取為在溫度57℃、超聲功率63瓦的條件下超聲提取11分鐘；
3）提取液調節pH值至3.8，在-21℃下冷凍，在21℃下融化，反覆凍融2次；最後一次融化後的提取液離心，離心條件為3600轉/分，離心時間19分鐘，取上清液過濾，得清液I；
4）向清液I中加入95％乙醇，攪拌，使清液I中乙醇含量在77％，9℃靜置19小時，濾取上清液，得清液II；
5）清液II調節pH值至6.9，在77℃下加熱19分鐘，冷卻至常溫後離心，離心條件為3600轉/分，離心時間19分鐘，取上清液過濾，得清液III；
6）清液III在-19℃下冷凍，凍實後在11℃下融化，過濾，清液用截留分子量6000道爾頓以下的超濾膜超濾2次，所得超濾液即為脾多肽提取物，分子量小於6000，多肽含量為11.8毫克/毫升；
7）取1000毫升上述脾多肽提取物，過濾至配置罐中，補加注射用水定容至2升，並調節pH值至6.5～7.0，經終端過濾後灌裝，製成5毫升/支的小容量注射劑，100℃滅菌30分鐘，包裝入庫，即得所述的脾多肽注射液，每毫升含有多肽5.9毫克/毫升。
對比例1、按照CN200410088895.5的方法製備脾多肽注射液
步驟1）：
A）取新鮮健康小牛脾臟10千克，除去筋膜及脂肪組織等雜質，用注射用水洗滌，加10升注射用水，勻漿，調節pH值3.8，-20℃冷凍，凍實後取出在15℃水浴中熔化，重複凍融2次；
B）最後一次融化後的勻漿液離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為15分鐘，上清液經紙漿過濾，濾液調pH值6.5後，加熱80℃，加熱時間為15分鐘，冷卻至35℃後離心，離心條件為4000轉/分，離心時間為20分鐘，經紙漿過濾，得清液；
C）-20℃冷凍，凍實後取出在12℃水浴中融化，紙漿過濾後，清液用截留分子量為6000的超濾膜（美國millipore公司，標準超濾系統）超濾一次，超濾液即為脾多肽提取物，分子量小於6000，多肽含量為8毫克/毫升。
步驟2）：
將上述脾多肽提取物1000毫升，加注射用水至2升，無菌過濾後灌裝，製成2毫升/支的小容量注射劑，100℃滅菌15分鐘，包裝入庫，每毫升含有多肽4毫克。
對比例2、不採用超聲提取的方法製備脾多肽注射液
1）取新鮮健康的除人以外的哺乳動物的脾臟10千克，剔除雜質及脂肪組織，得到乾淨的脾臟，加8倍脾臟重量的水勻漿，得勻漿液；
2）勻漿液調節pH值至4.0，在-20℃下冷凍，在18℃下融化，反覆凍融2次；最後一次融化後的提取液離心，離心條件為3800轉/分，離心時間18分鐘，取上清液過濾，得清液I；
3）向清液I中加入95％乙醇，攪拌，使清液I中乙醇含量在80％，5℃靜置18小時，濾取上清液，得清液II；
4）清液II調節pH值至6.8，在78℃下加熱18分鐘，冷卻至常溫後離心，離心條件為3800轉/分，離心時間18分鐘，取上清液過濾，得清液III；
5）清液III在-20℃下冷凍，凍實後在12℃下融化，過濾，清液用截留分子量6000道爾頓以下的超濾膜超濾2次，所得超濾液即為脾多肽提取物，分子量小於6000，多肽含量為8.2毫克/毫升；
6）取1000毫升上述脾多肽提取物,過濾至配置罐中，補加注射用水定容至2升，並調節pH值至6.8，經終端過濾後灌裝，製成2毫升/支的小容量注射劑，100℃滅菌30分鐘，包裝入庫，即得所述的脾多肽注射液，每毫升含有多肽4.1毫克。
對比例3、不添加乙醇的方法製備脾多肽注射液
1）取新鮮健康的除人以外的哺乳動物的脾臟10千克，剔除雜質及脂肪組織，得到乾淨的脾臟，加8倍脾臟重量的水勻漿，得勻漿液；
2）將勻漿液進行超聲提取，得提取液，其中，所述的超聲提取為在溫度55℃、超聲功率70瓦的條件下超聲提取12分鐘；
3）提取液調節pH值至4.0，在-20℃下冷凍，在18℃下融化，反覆凍融2次；最後一次融化後的提取液離心，離心條件為3800轉/分，離心時間18分鐘，取上清液過濾，得清液I；
4）清液I調節pH值至6.8，在78℃下加熱18分鐘，冷卻至常溫後離心，離心條件為3800轉/分，離心時間18分鐘，取上清液過濾，得清液II；
5）清液II在-20℃下冷凍，凍實後在12℃下融化，過濾，清液用截留分子量6000道爾頓以下的超濾膜超濾2次，所得超濾液即為脾多肽提取物，分子量小於6000，多肽含量為8.4毫克/毫升；
6）取1000毫升上述脾多肽提取物,過濾至配置罐中，補加注射用水定容至2升，並調節pH值至6.8，經終端過濾後灌裝，100℃滅菌30分鐘，包裝入庫，即得所述的脾多肽注射液，每毫升含有多肽4.2毫克。
試驗例1
該試驗例考察了超聲提取工藝中不同因素對提取率的影響。
1、液料比對提取率的影響
液料比即所加的水的質量與脾臟重量的比。液料比不同對提取率有一定的影響。該試驗在提取溫度為55℃、超聲功率為70瓦、提取時間為12分鐘，其他操作步驟同實施例1的步驟1）-步驟6）時，考察了不同液料比對提取率的影響，如圖1所示。由圖1可知，開始隨著液料比增大，脾多肽提取率增加，當液料比為6:1～10:1時，脾多肽提取率大於50％；而當液料比大於8:1以後，則出現降低的趨勢。因此，該發明中選擇液料比為6:1～10:1，優選8:1。
2、提取溫度對提取率的影響
該試驗在液料比為8:1、超聲功率為70瓦、提取時間為12分鐘，其他操作步驟同實施例1的步驟1）-步驟6）時，考察了不同提取溫度對提取率的影響，如圖2所示。由圖2可知，在一定範圍內脾多肽的提取率隨溫度升高而增加，當提取溫度為50～60℃時，脾多肽提取率大於50％；當提取溫度為55℃時提取率達到最大，此後，溫度上升提取率反而呈下降趨勢。因此，該發明中選擇提取溫度為50～60℃，優選55℃。
3、超聲功率對提取率的影響
該試驗在液料比為8:1、提取溫度為55℃、提取時間為12分鐘，其他操作步驟同實施例1的步驟1）-步驟6）時，考察了不同超聲功率對提取率的影響，如圖3所示。由圖3可知，隨超聲功率的增加，脾多肽提取率隨之提高，當提取功率為60～80瓦時，脾多肽提取率大於50％；當提取功率為70瓦時提取率達到最大，此後，超聲功率增加提取率反而呈下降趨勢。因此，該發明中選擇提取功率為60～80瓦，優選70瓦。
4、提取時間對提取率的影響
該試驗在液料比為8:1、超聲功率為70瓦、提取溫度為55℃，其他操作步驟同實施例1的步驟1）-步驟6）時，考察了不同提取時間對提取率的影響，如圖4所示。由圖4可知，隨著提取時間的延長，脾多肽提取率隨之提高，當提取時間為8～16分鐘時，脾多肽提取率大於50％；當提取時間為12分鐘時提取率達到最大，超過12分鐘後，提取率呈減少趨勢。因此，該發明中選擇提取時間為8～16分鐘，優選12分鐘。
試驗例2
該試驗例測定了不同方法製得的脾多肽注射液中多肽的含量，結果如表1所示。
/ | 實施例1 | 對比例1 | 對比例2 | 對比例3 |
多肽含量 | 6毫克/毫升 | 4毫克/毫升 | 4.1毫克/毫升 | 4.2毫克/毫升 |
試驗例3
游離胺基酸含量的測定
按GB標準測定該發明實施例1、對比例1、對比例2和對比例3得到的脾多肽提取物中主要游離aa含量（％），結果見表2所示。
/ | ASP | GLU | GLY | ALA | VAL | ILE | LEU | pHE |
實施例1 | 5.13 | 13.36 | 5.21 | 9.23 | 10.23 | 5.39 | 10.36 | 4.58 |
實施例2 | 5.07 | 13.3 | 5.14 | 9.12 | 10.13 | 5.21 | 10.2 | 4.48 |
實施例3 | 5.05 | 13.29 | 5.12 | 9.13 | 10.11 | 5.23 | 10.23 | 4.47 |
實施例4 | 5.06 | 13.28 | 5.13 | 9.11 | 10.12 | 5.22 | 10.21 | 4.45 |
實施例5 | 5.08 | 13.27 | 5.11 | 9.14 | 10.13 | 5.21 | 10.22 | 4.46 |
實施例6 | 5.07 | 13.29 | 5.1 | 9.12 | 10.12 | 5.22 | 10.21 | 4.45 |
對比例1 | 2.81 | 6.79 | 2.68 | 3.61 | 4.12 | 2.71 | 5.71 | 1.68 |
對比例2 | 2.91 | 2.83 | 2.72 | 3.64 | 4.19 | 2.78 | 5.78 | 1.73 |
對比例3 | 3.05 | 2.97 | 2.89 | 3.97 | 4.26 | 2.88 | 5.89 | 1.85 |
從上述試驗結果可以看出，採用該發明的方法製得的脾多肽提取物中主要游離胺基酸的含量明顯高於採用對比例的方法製得的脾多肽提取物。
試驗例4、臨床試驗
1、臨床背景
慢性B型肝炎患者80例，分為治療組和對照組，各男20例、女20例，年齡均為25-45歲，兩組病程均為1-2年，平均1.5年，所有患者均符合病毒性肝炎標準。
2、治療方法
治療組套用該發明實施例1的注射液和常規保肝藥物治療，一次肌肉注射該發明注射液5毫升，每周三次，一個月為一療程，對照組服用對比例1的注射液和常規保肝藥物治療。用藥前後檢查肝功能及B肝病毒五項指標。
3、療效判定
治癒：HBsAg.HBeAg轉陰，肝功能恢復正常；基本治癒：HBeAg轉陽，肝功能恢復正常；好轉：以上三項有一項轉為正常；無效：治療前後各項指標無變化。
4、治療結果：見表3所示：
組別 | 總例數 | 治癒（例） | 好轉（例） | 總有效率（％） |
治療組 | 40 | 25 | 12 | 92.5 |
對照組 | 40 | 20 | 13 | 82.5 |
從上述試驗結果可以看出，與對照組的脾多肽注射液相比，使用該發明的脾多肽注射液療效更加顯著。對該發明其它實施例的脾多肽注射液也進行了上述試驗，其獲得的結果相似。
榮譽表彰
2019年10月，《一種脾多肽注射液的製備方法》獲得第三屆吉林省專利獎金獎。
