《一種老壇泡菜固態發酵劑及其製備方法》是四川東坡中國泡菜產業技術研究院於2016年11月22日申請的專利，該專利申請號為2016110449444，公布號為CN106551322A，公布日為2017年4月5日，發明人是伍亞龍、張其聖、李恆、唐垚、申文熹等。該發明屬於食品領域，尤其是食品中泡菜發酵生物技術領域，具體為一種老壇泡菜固態發酵劑。
《一種老壇泡菜固態發酵劑及其製備方法》包括以下組分：微生物菌劑、營養組分、調味料和護色保脆組分；以質量百分計，微生物菌劑為10~15%，營養組分為40~45%；調味料為20~25%，護色保脆組分為20~25%，總質量百分含量為100%。該發明中所述的老壇泡菜固態發酵劑可實現傳統老壇泡菜工業化、規模化生產，同時可實現異地生產，使川渝以外地區的家庭領略自製泡菜的風味；相比同類老壇泡菜發酵劑（單一菌種），利用該發明固態發酵劑發酵老壇泡菜，其風味比傳統發酵更好，更宜人。
2021年11月，《一種老壇泡菜固態發酵劑及其製備方法》獲得2020年度四川專利獎三等獎。
（概述圖為《一種老壇泡菜固態發酵劑及其製備方法》的摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：一種老壇泡菜固態發酵劑及其製備方法
- 公布號：CN106551322A
- 申請號：2016110449444
- 申請人：四川東坡中國泡菜產業技術研究院
- 地址：四川省眉山市東坡區泡菜產業園區管委會政務中心
- 發明人：伍亞龍、張其聖、李恆、唐垚、申文熹、朱翔、張偉、王勇
- 專利代理機構：成都九鼎天元智慧財產權代理有限公司
- 代理人：呂玲
- Int.Cl.：A23L19/20(2016.01)I、A23L27/00(2016.01)I、A23L27/10(2016.01)I、A23L5/41(2016.01)I、A23L29/00(2016.01)I
- 類別：發明專利
- 生物寶藏：CGMCC No.12793 20160715;CGMCC No.12791 20160715;CGMCC No.12792 20160715
- 公布日：2017年4月5日
- 申請日：2016年11月22日
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
四川泡菜歷史悠久，是中國典型的傳統發酵食品之一，其營養豐富，味道可口，可增食慾，促進消化，享譽世界。同時，更是中國西南地區長期以來重要的烹飪食材和佐餐菜品。川渝一帶多為傳統陶壇式家庭泡菜，按照泡漬工藝可分為兩種：一種是選擇季節性蔬菜原料（如青菜）進行小規模化的中低鹽（4％～6％）長時間（1個月天以上），這種深度發酵的泡菜，具有高酸、低鹽、無殘糖的特點，當地人俗稱“老泡菜”，主要是用於川菜的烹調，如烹飪酸菜魚、酸菜面等；另一種是，選擇常見蔬菜，如蘿蔔、白菜、胡蘿蔔等，再輔以辣椒、生薑及八角、花椒等香辛料，採用多輪循環的方式發酵，並逐漸形成老母水。這種泡菜發酵時間短、鹽度低、風味佳、安全性高（如亞硝酸鹽含量很低，如附圖3），且含有豐富的高活性乳酸菌和豐富的胺基酸、有機酸（如附圖2、4），被當地人俗稱“洗澡泡菜”。通常新漬泡菜，風味不佳，需要發酵5天以上才能具備較好的風味。因此一般以老母水作為引子，進行泡菜製作，即可使泡菜快速成熟（12～14小時），形成良好風味，且保證泡菜安全，不易生花。這是因為老母水中含有豐富的活性乳酸菌，能使發酵快速啟動，同時抑制雜菌生長。傳統泡菜的老母水，若無明顯不良風味，可一直使用下去，可達二三十年，一些高山寺廟中老母水甚至可達四五十年。
隨著經濟發展，泡菜行業也得到了快速發展，一方面老壇酸菜基本實現了工藝化、規模化生產，但工業化酸菜鹽度高、發酵度淺，使用前需要脫鹽處理，再調味後食用，幾乎成了調味泡菜；而另一方面，2016年11月22日之前洗澡泡菜未能實現規模化、工業化生產。如今經濟發達，人民生活水平普遍提高，從而開始追求更高的生活質量，對產品的安全性、營養也要求更高。因此，對已經工業化的老壇酸菜，提高其風味，降低鹽度，是泡菜企業未來發展的一個方向；而對含有豐富活性乳酸菌、低鹽發酵、富含維生素的“洗澡泡菜”進行工業化、規模化則顯得非常迫切，成了泡菜企業未來發展的另一個重要方向。另外，隨著四川泡菜的知名度提升，以及人們對乳酸菌的認識提高，使得川渝以外地域的家庭也想製作泡菜，以期隨時隨地領略到泡菜美味。但由於其特有的工藝，發酵過程受到地域、季節、水質等條件多因素影響，很難實現工業化、規模化、異地化生產，也很難長時間保存、運輸。
為實現“洗澡泡菜”的工業化、規模化及異地生產，中國很科研人員一直致力於此，且有很多不錯的成果。如直投式乳酸菌粉，就是一種有著重要意義的發明。再如申請號為200810172333.7的發明專利，公開了“一種發酵劑發酵泡菜及其製備方法”，該發明特別涉及幾種純乳酸菌發酵劑發酵泡菜及其製備方法，其製備的步驟如下：
（1）原料蔬菜的處理：清洗、淋乾；
（2）鹽水的製備；
（3）發酵劑溶液的製備；
（4）蔬菜裝瓶並加入鹽水和發酵劑溶液；
（5）發酵。
該發明不但提供了一種含益生菌的食品發酵劑的一種新的深加工途徑，而且得到了一種新的傳統健康的泡菜。又如申請號201511034735.7的發明專利中公布了“蔬菜發酵生產用發酵劑”，該發明涉及微生物菌劑產品，含有植物乳桿菌,所述微生物菌劑產品由如下菌劑組成:植物乳桿菌、醋酸桿菌，首先對植物乳桿菌，醋酸桿菌進行單獨培養，培養到預定時間後經離心後收集菌體，利用常規微生物製劑的生產方法製備各菌的粉狀微生物菌粉；將製備的菌種粉劑根據配比進行混和調配。上述菌種的選擇和配比保障了泡菜產品的生產速度、泡菜產品良好的風味及質量使泡菜生產安全性高，產品標準一致，既可適合工業化大規模生產，又可用於手工作坊式生產，產品有較大的套用市場。但該專利中所涉及的植物乳桿菌，並非來源於泡菜，而是分離於新疆優酪乳中。事實上，中國科研工作者很少有對老母水形成過程中菌系變化的分析，且很多發酵劑都是植物乳桿菌等單菌構成，雖一定程度上可加速發酵，但所產泡菜風味遠遠不及四川傳統老壇泡菜。
發明內容
專利目的
《一種老壇泡菜固態發酵劑及其製備方法》的目的是利用該發酵劑發酵老壇泡菜，既可具備比傳統老壇泡菜更優良的風味、色澤和滋味，又可使乳酸菌、酵母菌等優勢微生物快速增殖，從而抑制致病菌的生長。該發酵劑，極具老壇泡菜工業化、規模化和異地生產廣闊前景。
技術方案
一種老壇泡菜固態發酵劑，該固態發酵劑包括以下組分：微生物菌劑、營養組分、調味料和護色保脆組分；以質量百分計，微生物菌劑為10～15％，營養組分為40～45％；調味料為20～25％，護色保脆組分為20～25％，總質量百分含量之和為100％。
所述老壇泡菜固態發酵劑的製備方法，包括以下步驟：
（1）微生物菌劑的製備
選取Lactobacillus pentosus PCYSWX-5，Lactobacillus brevis PCYTY-7和Kazachstania exigua PCYWYL-53株菌種進行培育，使其活菌數之比為10:1:1，即10:10:10；然後將Lactobacillus pentosus PCYSWX-5、Lactobacillus brevis PCYTY-7乳酸菌分別進行高密度培養，再高速離心獲取菌泥，以菌泥體積百分含量計，加入10～20％的海藻糖作為保護劑，然後進行冷凍乾燥，製成粉劑1#和粉劑2#；乾燥溫度-60至-50℃，真空度1帕，時間30-35小時，離心轉速為10000轉/分，每一種菌粉中的活菌數約為5×10～1×10。 將Kazachstania exigua進行高密度增殖培養，再高速離心獲取菌泥，以菌泥體積百分含量計，加入10～20％的海藻糖作為保護劑，然後進行噴霧乾燥，製成粉劑3#，乾燥溫度-60至-50℃，真空度1帕，時間30-35小時，離心轉速為10000轉/分，該菌粉中的活菌數約為5×10～1×10；然後將粉劑1#、2#、3#菌粉按比例復配成複合菌粉。
（2）營養組分的製備
選擇葡萄糖、檸檬酸銨、磷酸氫二鉀和硫酸錳分別為碳源、氮源和無機鹽；復配比例為檸檬酸銨10～15％、磷酸氫二鉀5～10％、硫酸錳1～2％，其餘由葡萄補足，總質量百分含量為100％。
（3）調味料
選擇花椒和八角粉末或其提取物粉末1:1混合，以香辛料混合物質量百分含量計，味素的添加量為10～20％。
（4）護色保脆組分選擇氯化鈣為護色保脆劑。
（5）復配製備將微生物菌劑、營養組分、調味料和護色保脆組分按比例混合，然後壓製成型，每塊重40～50克。
所述的Lactobacillus pentosus PCYSWX-5，分類命名為戊糖乳桿菌的菌株Lactobacillus pentosus，保藏日期為2016年7月15日，保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No：12793。保藏單位地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
所述的Lactobacillus brevis PCYTY-7，分類命名為短乳桿菌Lactobacillus brevis，保藏日期為2016年7月15日，保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No：12792。保藏單位地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
所述的Kazachstania exigua PCYWYL-5，分類命名為Kazachstania exigua，保藏日期為2016年7月15日，保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No：12791。保藏單位地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
改善效果
（一）該發明中所述的老壇泡菜固態發酵劑可實現傳統老壇泡菜工業化、規模化生產及地生產，使川渝以外地區的家庭領略到自製泡菜的風味；
（二）相比同類老壇泡菜發酵劑（單一菌種），利用該發明固態發酵劑發酵老壇泡菜，其風味比傳統發酵更好，更宜人；
（三）包含微生物快速增殖營養物質，每一塊固態發酵劑所包含的營養物質能夠保證每一塊固態發酵中微生物快速增殖，可快速啟動發酵，同時，能更好的抑制致病菌生長；
（四）調料組分中所包含的香辛料提取物、味素、花椒，可以在發酵中及時對老壇泡菜進行調味，這樣香味物質更容易滲透在泡菜內部，賦予老壇泡菜更好的滋味；
（五）添加適量護色保脆劑，可以在老壇泡菜發酵過程中保持泡菜固有的色澤和脆度，賦予老壇泡菜更好的色澤和質地。
附圖說明
圖1：泡菜母水生態系統穩定後Lactobacillus pentosus、Lactobacillus brevis和Kazachstania exigua活菌計數圖，確定了微生物菌劑中三種微生物的比例為10:1:1；
圖2：研究四川傳統母水進化系統時總酸和pH的變化；
圖3：四川泡菜母水進化系統中乳酸菌系統發育樹分析，確定發酵系統穩定後，優勢乳酸菌為Lactobacillus pentosus、Lactobacillus brevis；
圖4：四川泡菜母水進化系統中酵母菌系統發育樹分析，確定發酵系統穩定後，優勢酵母菌為Kazachstania exigua；
圖5為實施例1中記載的不同發酵方式對泡菜感官影響評價圖；
圖6為實施例1中記載的不同組分對泡菜感官影響的評價圖。
權利要求
1.一種老壇泡菜固態發酵劑，其特徵在於該固態發酵劑包括以下組分：微生物菌劑、營養組分、調味料和護色保脆組分；以質量百分計，微生物菌劑為10~15%，營養組分為40~45%；調味料為20~25%，護色保脆組分為20~25%，總質量百分含量為100%；該老壇泡菜固態發酵劑的製備方法包括以下步驟：
（1） 微生物菌劑的製備
選取Lactobacillus pentosus PCYSWX-5，Lactobacillus brevis PCYTY-7和Kazachstania exigua PCYWYL-5共3株菌種進行培育，使其活菌數之比為10:1:1，即10:10:10；然後將Lactobacillus pentosus PCYSWX-5、Lactobacillus brevis PCYTY-7乳酸菌分別進行高密度培養，再高速離心獲取菌泥，以菌泥質量百分含量計，加入10~20%的海藻糖作為保護劑，然後進行冷凍乾燥，製成粉劑1#和粉劑2#；將Kazachstania exigua進行高密度增殖培養，再高速離心獲取菌泥，以菌泥質量百分含量計，加入10~20%的海藻糖作為保護劑，然後進行噴霧乾燥，製成粉劑3#；然後將粉劑1#、2#、3#菌粉按10:1:1的比例復配成菌粉；
（2） 營養組分的製備
（3） 調味料
選擇花椒和八角粉末或其提取物粉末1:1混合，以香辛料混合的質量百分含量計，味素的添加量為10~20%；
（4） 護色保脆組分
選擇氯化鈣為護色保脆劑；
（5） 復配製備
將微生物菌劑、營養組分、調味料和護色保脆組分按比例混合，然後壓製成型，每塊重40~50克；所述的Lactobacillus pentosus PCYSWX-5保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12793，所述的Lactobacillus brevis PCYTY-7保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12792，Kazachstania exigua PCYWYL-5保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12791。
實施方式
- 實施例1
《一種老壇泡菜固態發酵劑及其製備方法》包括以下步驟：微生物菌劑的製備老壇泡菜是由乳酸菌、酵母菌等微生物主導發酵而成的。對老壇泡菜母水發酵系統中的微生物進行分離純化、鑑定，確定出主導發酵的微生物種屬及活菌比例，然後通過功能篩選，確定具體菌株。最終採用冷凍或噴霧乾燥工藝製成菌劑，再按活菌比例復配而成。因此，老壇泡菜固態發酵劑微生物菌劑及其製備的具體步驟如下：
1）優勢微生物菌屬及活菌比例確定：基於可培養方法對傳統老壇泡菜母水發酵系統中的微生物進行分離純化、分子鑑定，並結合高通量測序、多重PCR等多種免培養方法，最終確定了發酵老壇泡菜的主要微生物，即為Lactobacillus pentosus、Lactobacillus brevis和Kazachstania exigua。在母水發酵達到穩態時，這三種微生物的活菌數之比約為10:1:1（即10:10:10）。再通過產酸性能、抑菌性能等方面篩選出3株代表性優勢微生物：Lactobacillus pentosus PCYSWX-5，Lactobacillus brevis PCYTY-7和Kazachstania exigua PCYWYL-5這3株微生物已在CGMCC專利菌種保藏中心保藏，其保藏編號分別為：CGMCC NO.12793；CGMCC NO.12792；CGMCC NO.12791；
2）乳酸菌粉製備：將2株乳酸菌分別在最佳化後的玉米培養基中進行高密度培養，高速離心獲取菌泥，並加入10～20％的海藻糖作為保護劑，然後進行冷凍乾燥，製成粉劑1#（Lactobacillus pentosus PCYSWX-5）、2#（Lactobacillus brevis PCYTY-7）；
3）酵母菌劑製備：將Kazachstania exigua PCYWYL-5在最佳化改良後的玉米培養基中進行高密度增殖培養，高速離心獲取菌泥，以菌泥質量百分含量計，加入10～20％的海藻糖作為保護劑，進行噴霧乾燥，製成粉劑3#；粉劑的製作可以採用現有技術進行製備。
4）微生物菌劑復配：將1#、2#、3#菌粉按比例復配成菌粉按比例配置成老壇泡菜固態發酵劑中的微生物菌劑組分A。
營養組分的製備分別稱取檸檬酸銨13克 、磷酸氫二鉀6克，硫酸錳1克，葡萄糖80克，混勻復配成營養組分B。
調味組分及護色保脆組分的製備稱取200克花椒粉末，200克八角粉末，粉碎成過篩160～180目的粉末，1:1混合，稱取100克香料混合物，添加15克味素混合均勻作為調味料；選擇氯化鈣為護色保脆劑；
復配製備稱取微生物菌劑組分A6克；營養組分B16克；調味料組分10克；護色保脆8克，混合均勻後壓片成型，壓成圓形，即為40克老壇泡菜固態發酵劑。
實驗1
1）稱取蓮花白400克，胡蘿蔔200克，白蘿蔔200克，小米辣50克，食鹽50克，涼開水1600克，老壇泡菜固態發酵劑40～80克（1～2片）。將蔬菜原料清洗、切分，將食鹽化入涼開水中，將固態發酵劑先溶入40～50℃溫水中；然後將原輔料投入2.5升陶壇中，加入發酵劑溶液，再加入食鹽水，密封后置於23℃發酵。並檢測總酸、pH，總酸積累達到0.4％時（一般認為總酸04-0.8％時泡菜成熟），取出泡菜，由10名接受過培訓的感官人員來按照表1標準進行評價（下同）。
項目 | 標準 | 得分 |
|---|---|---|
色澤（5分） | 色澤明亮，具有較好光澤度 | 5 |
色澤一般，無明顯變質現象 | 3-4 | |
色澤變暗，有變暗現象 | 0-2 | |
形態（5分） | 大小均勻，呈現固有形態 | 5 |
大小比較均勻，無雜質 | 3-4 | |
形態大小不太均勻，有菜屑 | 0-2 | |
香氣（5分） | 具有濃郁的發酵型香氣，無不良氣味 | 5 |
具有清淡發酵型香氣，無不良氣味 | 3-4 | |
無香氣，有明顯異味 | 0-2 | |
質地滋味（5分） | 口感脆嫩，滋味鮮美，酸甜成度適宜 | 5 |
口感較脆嫩，酸甜度適宜 | 3-4 | |
脆嫩度一般，滋味一般 | 0-2 |
2）如1）中泡菜製作流程，不添加老壇泡菜發酵劑，自然發酵，待總酸積累達到0.4％時，取出泡菜進行感官評定。
3）如1）中泡菜製作流程，按說明添加某公司單菌泡菜發酵劑，待總酸積累達到0.4％時，取出泡菜進行感官評定。
4）使用效果：
根據總酸檢測結果：3種不同發酵方式所需時間相差不大，發酵2d時，總酸積累都達到0.4％時，但含量稍微不同：老壇發酵劑發酵的泡菜總酸為0.56克/毫升，自然發酵泡菜總酸為0.42克/毫升，某公司單菌發酵劑發酵泡菜總酸為0.46克/毫升。
感官評定結果如下圖5所示，不同發酵方式泡菜感官評價為：老壇泡菜固態發酵劑發酵泡菜>傳統老壇泡菜>某公司發酵劑發酵泡菜。由此可見，該發明老壇泡菜固態發酵劑發酵泡菜的風味優於單菌發酵和自然發酵的四川泡菜。可用以實現老壇泡菜的工業化、異地生產。
實驗2
1）如實驗1中1）所述的泡菜流程製作泡菜，標為“泡1”，待總酸積累達到0.4％時，取出泡菜進行感官評定（方法如實驗1中1）所述）。
2）如實驗1中1）所述的泡菜流程和參數製作泡菜，但所使用的老壇泡菜發酵劑僅不包含微生物菌劑組分A，標為“泡2”，待總酸積累達到0.4％時，取出泡菜進行感官評定。 3）如實驗1中1）所述的泡菜流程及參數製作泡菜，但所使用的老壇泡菜發酵劑僅不包含營養組分B，標為“泡3”，待總酸積累達到0.4％時，取出泡菜進行感官評定。
4）如實驗1中1）所述的泡菜流程及參數製作泡菜，但所使用的老壇泡菜發酵劑僅不包含調味料組分C和護色保脆組分D，標為“泡4，待總酸積累達到0.4％時，取出泡菜進行感官評定。
5）對比結果：
根據總酸檢測結果：3種不同發酵方式成熟時間不同，總酸積累都達到0.4％時，“泡1”需要24h，總酸為0.46克/毫升；“泡2”需要48h，總酸為0.44克/毫升；“泡3”需要48h總酸為0.41克/毫升；“泡4”需要24h總酸,為0.48克/毫升。由此可見，不加營養組分B和微生物菌劑組分A,明顯延長了泡菜發酵時間，增加安全風險；不加調味料組分C和護色保脆組分D，對成熟時間影響不大，但對泡菜的感官質量影響較大。
感官評定結果如下圖6所示，其結果為：“泡1”>“泡2”>“泡3”>“泡4”，可見調味料成分和護色保脆對泡菜質量有較大的影響，其次是營養組分，和微生物組分。因此，要想達到發酵最佳的結果，該老壇固態發酵劑的所有組分缺一不可。
- 實施例2
一種老壇泡菜固態發酵劑的製備方法，包括以下步驟：微生物菌劑的製備如實施例1中所述，製備微生物菌劑組分A。營養組分的製備分別稱取檸檬酸銨12克、磷酸氫二鉀8.5克，硫酸錳1.5克，葡萄糖78克，混勻復配成營
養組分B。
調味組分及護色保脆組分的製備
稱取200克花椒粉末，200克八角粉末，粉碎成過篩160～180目的粉末，1:1混合，稱取100克香料混合物，添加20克味素混合均勻作為調味料；選擇氯化鈣為護色保脆劑。
復配製備
稱取微生物菌劑組分A4克；營養組分B18克；調味料組分8克；護色保脆10克，混合均勻後壓片成型，壓成圓形，即為40克老壇泡菜固態發酵劑。
使用方法：
稱取青菜3000克，食鹽400克，涼開水6000克，老壇泡菜固態發酵劑160～240克（4～6片）。將蔬菜原料清洗整理，不切分，同時將食鹽化入涼開水中，將固態發酵劑溶入40～50℃溫水中；然後將青菜整齊投入10L陶壇中，加入發酵劑溶液，再加入食鹽水，密封后置於23℃發酵。
使用效果：發酵過程中檢測總酸、pH，一般認為泡菜酸度積累達到0.4-0.8％，即認為泡菜成熟，風味最佳，可食用。本發酵劑發酵15天時，總酸達到0.43克/毫升，即可脫鹽，進一步加工。
酸菜感官評定：10名接受過培訓的感官人員來按照表1標準進行評價。結果如圖1所示，不同發酵方式感官評分為：老壇泡菜固態發酵劑發酵泡菜>傳統老壇泡菜>某公司發酵劑發酵泡菜。
項目 | 標準 | 得分 |
|---|---|---|
色澤（5分） | 色澤明亮，具有較好光澤度 | 5 |
色澤一般，無明顯變質現象 | 3-4 | |
色澤變暗，有變暗現象 | 0-2 | |
形態（5分） | 大小均勻，呈現固有形態 | 5 |
大小比較均勻，無雜質 | 3-4 | |
形態大小不太均勻，有菜屑 | 0-2 | |
香氣（5分） | 具有濃郁的發酵型香氣，無不良氣味 | 5 |
具有清淡發酵型香氣，無不良氣味 | 3-4 | |
無香氣，有明顯異味 | 0-2 | |
質地滋味（5分） | 口感脆嫩，滋味鮮美，酸甜成度適宜 | 5 |
口感較脆嫩，酸甜度適宜 | 3-4 | |
脆嫩度一般，滋味一般 | 0-2 |
榮譽表彰
2021年11月，《一種老壇泡菜固態發酵劑及其製備方法》獲得2020年度四川專利獎三等獎。
