一種白肉靈芝新菌種及其栽培方法和套用:專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益

《一種白肉靈芝新菌種及其栽培方法和套用》是廣東省微生物研究所、廣東粵微食用菌技術有限公司於2016年4月20日申請的專利，該專利的公布號為CN105861321A，授權公布日為2016年8月17日，發明人是胡惠萍、吳清平、謝意珍。

《一種白肉靈芝新菌種及其栽培方法和套用》所述松杉靈芝新菌種為白肉靈芝Ganoderma leucocontextum HMGIM-Z110122，保藏編號為CCTCC NO：M2016087。白肉靈芝CCTCC M2016087的栽培方法包括組織分離菌種後製作母種，製作原種，製作生產種，栽培培養及出芝管理。該發明的有益效果是：該發明提供一種白肉靈芝新菌種，並且還提供了相應的人工栽培方法。該白肉靈芝2016年前稀少，能有效促進小鼠脾細胞增殖，營養價值高，具有很好的經濟效益和社會效益。

2021年11月，《一種白肉靈芝新菌種及其栽培方法和套用》獲得第八屆廣東專利獎銀獎。

（概述圖為《一種白肉靈芝新菌種及其栽培方法和套用》摘要附圖）

基本介紹

中文名：一種白肉靈芝新菌種及其栽培方法和套用
別名：一種白肉靈芝菌種及其栽培方法和套用
申請人：廣東省微生物研究所、廣東粵微食用菌技術有限公司
申請日：2016年4月20日
申請號：2016102466768
公布號：CN105861321A
公布日：2016年8月17日
發明人：胡惠萍、吳清平、謝意珍
地址：廣東省廣州市先烈中路100號廣東省微生物研究所
分類號：C12N1/14(2006.01)I、C12N5/071(2010.01)I、C12R1/645(2006.01)N、A01G1/04(2006.01)N等
代理機構：廣州弘邦專利商標事務所有限公司
代理人：張釔斌
類別：發明專利

專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,

專利背景

靈芝（Ganoderma）在中國有悠久的藥用歷史，長期被人們用於氣管炎、肝炎、高血壓、腫瘤、免疫力紊亂等病症的輔助治療。現代的藥理和臨床研究結果也表明靈芝含有抑制腫瘤和調節免疫的活性成分。自DONK（1948）建立靈芝科（Ganodermataceae）以來，2016年前全世界已報導的靈芝科大型真菌共200餘種，我國有記載的靈芝有103種，其中14種已被人們所利用。2016年前在中國國內廣泛套用的品種包括赤芝（Ganoderma lucidum），紫芝（Ganodermasinense）等，靈芝屬的許多其它種類也具有類似的效果，值得進一步研究。

2016年前，關於白肉靈芝的專利申請主要是關於白肉靈芝的提取物用途方面的研究。該申請的白肉靈芝新菌種是在林芝市波密縣扎西崗鄉的闊葉林中青岡樹根部採集並分離的新菌種，經研究，未見該菌種的研究報導。

發明內容

專利目的

該發明提供一種白肉靈芝新菌種及其人工栽培方法和用途。

技術方案

《一種白肉靈芝新菌種及其栽培方法和套用》通過以下方案達到上述目的：該發明的白肉靈芝新菌采自西藏林芝地區波密縣扎西崗鄉的闊葉林中，經鑑定為白肉靈芝新菌種，並且組織分離獲得原始菌株，命名為白肉靈芝Ganodermaleucocontextum HMGIM-Z110122，於2016年3月7日保藏於中國典型培養物保藏中心（簡稱CCTCC，地址為：湖北省武漢市武昌區八一路珞珈山），保藏編號為CCTCC NO：M 2016087）。

上述白肉靈芝CCTCC M 2016087新菌種的栽培方法，包括組織分離菌種後製作母種，製作原種，製作生產種，栽培培養及出芝管理。

在一個優選的實施例中，上述白肉靈芝新菌種的栽培方法中製作母種的培養基為綜合PDA培養基，所述綜合PDA培養基的配方按質量百分比計為馬鈴薯18-20％，優選為20％、葡萄糖1.5-2％，優選為2％、瓊脂2-2.5％，優選為2％、磷酸二氫鉀0.15-0.3％，優選為0.3％、硫酸鎂0.05-0.15％，優選為0.15％、維生素B1微量，其餘為水。

在一個優選的實施例中，上述白肉靈芝新菌種的栽培方法中製作原種的原種料的原料組成按質量百分比計為高粱75-79％、小米16-20％、CaCO₃1-2％、含水量55-60％。

在一個優選的實施例中，上述白肉靈芝新菌種的栽培方法中製作生產種的生產種料的原料組成按質量百分比計為棉籽殼87-89％、麩皮10-12％、CaCO₃1-2％或棉籽殼48-52％、木屑25-30％、麩皮18-20％、碳酸鈣1-2％、硫酸鈣1-2％，含水量55-60％。

在一個優選的實施例中，上述白肉靈芝新菌種的栽培方法中栽培料的原料組成按質量百分比計為木屑75-78％、麩皮20-22％、CaCO₃1-2％，含水量60-65％

該發明提供一種優選的白肉靈芝CCTCC M 2016087新菌種的栽培方法，包括以下步驟：

（1）製作母種：採集組織分離的菌種白肉靈芝，將菌種無菌接至綜合PDA斜面，置於20-25℃培養箱中恆溫暗培養，直至菌絲長滿斜面即得生產母種，其中所述綜合PDA斜面的配方按質量百分比計為馬鈴薯18-20％，優選為20％、葡萄糖1.5-2％，優選為2％、瓊脂2-2.5％，優選為2％、磷酸二氫鉀0.15-0.3％，優選為0.3％、硫酸鎂0.05-0.15％，優選為0.15％、維生素B1微量，其餘為水；

（2）製作原種：將生產母種無菌接入原種袋中，置於25℃培養箱中恆溫暗培養，至菌絲吃滿料後即得原種，其中原種料的原料組成按質量百分比計為高粱75-79％、小米16-20％、CaCO₃1-2％、含水量55-60％，將所述原種料裝入菌種袋中，製得原種袋；

（3）製作生產種：將原種無菌接入生產種袋中，置於25℃培養箱中恆溫暗培養，至菌絲吃滿料後即得生產種，其中生產種料的原料組成按質量百分比計為棉籽殼87-89％、麩皮10-12％、CaCO₃1-2％或棉籽殼48-52％、木屑25-30％、麩皮18-20％、碳酸鈣1-2％、硫酸鈣1-2％，含水量55-60％，將所述將生產種料裝入菌種袋中，製得生產種袋；

（4）接種栽培：將生產種無菌接入栽培料袋中，在25℃±1℃培養室中避光培養，待栽培袋中的菌絲長滿栽培料後，繼續遮光後熟培養至菌絲完成後熟期，其中栽培料的原料組成按質量百分比計為木屑75-78％、麩皮20-22％、CaCO₃1-2％，含水量60-65％，將所述栽培料裝入菌種袋中，製得栽培袋；

（5）出芝管理：調節溫度為20-21℃、濕度85-90％、光照100-200lux，不通氣，保持CO₂含量在2000ppm以上至長出原基，調整溫度為26-28℃、空氣相對濕度85-90％、光照約200-300lux，不通氣，繼續保持CO₂含量在2000ppm以上，待菌柄伸長期結束並進入菌蓋生長期時，通氣，調整溫度為26-28℃，濕度85-95％，光照300-500lux，通氣，保持CO₂含量小於1200ppm，至菌蓋的白邊完全變黃時，採摘。

優選的，上述步驟（4）中的培養室的空氣相對濕度為60-70％。該發明另一方面還提供一種上述白肉靈芝CCTCC M 2016087新菌種用於細胞增殖的用途，特別是用於脾細胞增殖的用途。在一個優選的示例性實施例中，提供一種上述白肉靈芝CCTCC M 2016087的提取物用於細胞增殖的用途，特別是用於脾細胞增殖的用途。該發明研究者證實了白肉靈芝CCTCC M 2016087水提取物對脾細胞具有顯著的增殖效果。

該發明的白肉靈芝CCTCC M 2016087子實體具有以下的形態特徵和外觀特徵：菌蓋10-20*5-10厘米，近柄處厚2-3厘米，扇形或半圓形扇形，大部分紅至紅褐色，幼嫩時及成熟時邊緣白至淺黃色，漸變黃至紅褐色，成熟後接近菌柄部分呈暗紅褐色、暗紫紅褐色或幾乎黑紅褐色，具漆樣光澤，具同心環紋，常有弱的放射狀皺紋。

孔口表面新鮮時白色至奶油色，受傷處帶褐色至褐色。孔口近圓形，每毫米4-6個。菌管長達4-6毫米，不分層，赭色到淡灰褐色或灰褐色。菌肉厚達2.2厘米，白色，乾後白至近白色或微帶奶油色，軟木栓質至木栓質，近表皮有一薄的帶褐色緊密層（皮殼）。

菌柄5-8*3.5-5.5厘米，圓柱形至略扁，側生至偏生，有時近無柄，暗紅褐色至暗紫褐色，具光澤，內部白色。孢子廣橢圓形，頂端平截，淺褐色，雙層壁，內壁具小刺，非澱粉質，包括最外孢層時為9.5-12.5*7-9微米，不包括最外孢層時為8.0-9.0*5-6.5微米。

經分子生物學鑑定，其ITS分子序列測定及分析結果接近白肉靈芝，相似度達90％以上，結合形態特徵與微觀特徵及分子鑑定結果，得出其為白肉靈芝新菌種。

有益效果

《一種白肉靈芝新菌種及其栽培方法和套用》的有益效果是：該發明提供一種白肉靈芝新菌種，並且還提供了相應的人工栽培方法。該白肉靈芝2016年前稀少，有效成分含量較高，並能有效促進小鼠脾細胞增殖，營養價值高，具有很好的經濟效益和社會效益。

附圖說明

圖1採用實施例1的栽培方法得到白肉靈芝。

附圖說明

權利要求

1.一種白肉靈芝新菌種，其特徵在於，所述白肉靈芝新菌種為白肉靈芝Ganodermaleucocontextum HMGIM-Z110122，保藏編號為CCTCC M 2016087。

2.一種如權利要求1所述的白肉靈芝新菌種的栽培方法，其特徵在於，包括組織分離菌種後製作母種，製作原種，製作生產種，栽培培養及出芝管理。

3.一種如權利要求2所述的白肉靈芝新菌種的栽培方法，其特徵在於，所述製作母種的培養基為綜合PDA培養基，所述綜合PDA培養基的配方按質量百分比計為馬鈴薯18-20％、葡萄糖1.5-2％、瓊脂2-2.5％、磷酸二氫鉀0.15-0.3％、硫酸鎂0.05-0.15％、維生素B1微量，其餘為水。

4.一種如權利要求2所述的白肉靈芝新菌種的栽培方法，其特徵在於，所述製作原種的原種料的原料組成按質量百分比計為高粱75-79％、小米16-20％、CaCO₃1-2％、含水量55-60％。

5.一種如權利要求2所述的白肉靈芝新菌種的栽培方法，其特徵在於，所述製作生產種的生產種料的原料組成按質量百分比計為棉籽殼87-89％、麩皮10-12％、CaCO₃1-2％或棉籽殼48-52％、木屑25-30％、麩皮18-20％、碳酸鈣1-2％、硫酸鈣1-2％，含水量55-60％。

6.一種如權利要求2所述的白肉靈芝新菌種的栽培方法，其特徵在於，所示栽培培養的栽培料的原料組成按質量百分比計為木屑75-78％、麩皮20-22％、CaCO₃1-2％，含水量60-65％。

7.一種如權利要求2至6中任一權利要求所述的白肉靈芝新菌種的栽培方法，其特徵在於，包括以下步驟：

（1）製作母種：採集組織分離的菌種白肉靈芝，將菌種無菌接至綜合PDA斜面，置於20-25℃培養箱中恆溫暗培養，直至菌絲長滿斜面即得生產母種，其中所述綜合PDA斜面的配方按質量百分比計為馬鈴薯18-20％、葡萄糖1.5-2％、瓊脂2-2.5％、磷酸二氫鉀0.15-0.3％、硫酸鎂0.05-0.15％、維生素B1微量，其餘為水；

8.一種如權利要求7所述的白肉靈芝新菌種的栽培方法，其特徵在於，所述步驟（4）中的培養室的空氣相對濕度為60-70％。

9.一種如權利要求1所述的白肉靈芝新菌種的套用，其特徵在於，所述白肉靈芝新菌種用於細胞增殖。

10.一種如權利要求9所述的白肉靈芝新菌種的套用，其特徵在於，所述細胞增殖為脾細胞增殖。

實施方式

實施例1

白肉靈芝（CCTCC M 2016087）的人工栽培方法，包括以下步驟：

1）按質量百分比計為馬鈴薯20％、葡萄糖2％、瓊脂2％、磷酸二氫鉀0.3％、硫酸鎂0.15％及微量維生素B1、其餘為水的原料組成常規製作綜合PDA斜面，0.11兆帕大氣壓、121℃高溫高壓濕熱滅菌30分鐘；

2）按質量百分比計為高粱78％、小米20％、CaCO₃2％的原料組成，含水量60％，製作原種料，將原種料裝入13厘米×25厘米的耐高溫透明聚丙烯菌種袋中，用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑膠環，並扣上配套的蓋子，製得原種袋，折合每原種袋裝乾料300克；

3）按質量百分比計為棉籽殼89％、麩皮10％、CaCO₃1％的原料組成，含水量55％，製作生產種料，將生產種料裝入15厘米×30厘米的耐高溫透明聚丙烯菌種袋中，用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑膠環，並扣上配套的蓋子，製得生產種袋，折合每生產種袋裝乾料350克；

4）按質量百分比計為木屑78％、麩皮20％、CaCO₃2％的原料組成，含水量60％，製作栽培料，將栽培料裝入17厘米×35厘米的耐高溫透明聚丙烯菌種袋中，用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑膠環，並扣上配套的蓋子，製得栽培袋，折合每袋裝乾料500克；

5）製作母種：採集組織分離的菌種白肉靈芝CCTCC M 2016087，將菌種無菌接至綜合PDA斜面，置於25℃培養箱中恆溫暗培養，直至菌絲長滿斜面（約7天左右）即得生產母種；

6）製作原種：將生產母種無菌接入原種袋中，接種時確保母種料塊埋入原種料中，然後置於25℃培養箱中恆溫暗培養，至菌絲吃滿料後（約25天左右）即得原種；

7）製作生產種：將原種無菌接入生產種袋中，置於25℃培養箱中恆溫暗培養，至菌絲吃滿料後即得生產種；

8）接種栽培：將生產種無菌接入栽培料袋中，在25℃±1℃、空氣相對濕度60-70％的培養室中避光培養，待栽培袋中的菌絲長滿栽培料後（大約30-35d），繼續遮光後熟培養15d至菌絲完成後熟期，切下套環及老種塊；

9）出芝管理：調節溫度為20-21℃、濕度85-90％、光照100-200lux，不通氣，保持CO₂含量在2000ppm以上至長出原基，調節溫度為26-28℃、空氣相對濕度85-90％、光照約200-300lux，不通氣，繼續保持CO₂含量在2000ppm以上，待菌柄伸長期結束並進入菌蓋生長期時，通氣，調整溫度為26-28℃，濕度85-95％，光照300-500lux，通氣，保持CO₂含量小於1200ppm，至菌蓋的白邊完全變黃時，採摘。

該實施例栽培得到的白肉靈芝如圖1所示。

實施例2

細胞增殖實驗

1、赤芝水提取物和白肉靈芝水提物製備

將商購赤芝和白肉靈芝CCTCC M 2016087子實體分別粉碎後，按料液比1:10分別加入蒸餾水，於90℃水浴中恆溫3小時，過濾，濾渣重複提取2小時，過濾，合併濾液濃縮至料液為1:5後，加5倍體積的無水乙醇靜置1小時，然後過濾，將醇沉後的沉澱凍乾後，分別得到赤芝水提取物和白肉靈芝水提物。

2、細胞培養

斷頭法處死小鼠，將血放掉洗淨，在酒精中浸泡3分鐘消毒。無菌操作，將小鼠背朝下放在解剖板上，用鑷子提起腹部皮膚，剪開。沿開口向兩側斜著剪開，翻起皮膚露出腹腔，即可看到白色的胃。提起胃，找到後麵條狀的脾，用彎頭鑷子取出脾，將周圍的脂肪組織去除。用無胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養基清洗2次待用。

將取出的用脾臟進行無菌研磨，過100目篩。收集過濾的脾細胞，用無FBS的RPMI-1640培養基吸取分散的細胞懸液吹勻，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清。

加入Tris-NH₄Cl裂解紅細胞，充分吹勻。1000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清。重複一次。加入無PBS的RPMI-1640培養基，懸浮，吹勻，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清。

加入完全RPMI-1640培養基，懸浮，吹勻，計算細胞數並鋪96孔板。

3、測定

將鋪好板的96孔板放入37℃，5％CO₂培養箱中培養4小時。

將上述製備的赤芝水提物和白肉靈芝水提物分別按濃度（100微克/毫升、200微克/毫升、400微克/毫升）分組加入96孔板，設定PBS為陰性對照。

在37℃，5％CO₂培養箱中培養44小時後，結束培養，每孔加入20微升噻唑藍（MTT），繼續培養4小時。

繼續培養4小時後，棄上清，每孔加入150微升二甲基亞碸（DMSO）並振盪10s，酶標儀於570納米處測定吸光度值。

3.結果及分析

採用SPSS計算赤芝水提物和白肉靈芝水提物對小鼠脾淋巴細胞增殖百分比值，結果如表1所示。

表1：不同濃度的赤芝水提物和白肉靈芝水提物的脾細胞增殖結果

	赤芝水提物			門肉靈芝水提物
水提物濃度	脾細胞增殖百分比均值（%）	標準差	P	脾細胞增殖百分比均值（%）	標準差	P
400微克/毫升	111.3	1.633	**	118.6	11.425
200微克/毫升	106.4	3.658	—	117.5	8.159	**
100微克/毫升	106.3	2.918	—	113.8	10.822	**

註：**：P<0.01極顯著差異，--：無差異。

從表1可知，與赤芝水提物相比，白肉靈芝CCTCC M 2016087水提物在脾細胞增殖實驗中表現突出，尤其是在較低濃度的情況下也能夠有效促進小鼠脾細胞增殖，在濃度較低（＜200微克/毫升）下，赤芝水提物對於脾細胞的增殖作用不明顯，而白肉靈芝水提物達到顯著性差異，甚至濃度低至100微克/毫升時也能實現增殖脾細胞的顯著作用。這可能表明，白肉靈芝CCTCC M 2016087刺激免疫活性的功能較強，是一個具有開發潛力的食藥用菌品種。

實施例3

活性成分含量測定

1、粗多糖的提取與含量測定

分別稱取0.25克赤芝（商購）子實體和0.25克白肉靈芝CCTCC M 2016087子實體，粉碎，按料水比1:40比例加入蒸餾水，沸水浴2小時，2000克離心15分鐘，殘渣加入等量蒸餾水沸水浴1小時，2000克離心15分鐘，沉澱物再用5毫升蒸餾水洗滌，2000克離心15分鐘，合併3個上清液，並用蒸餾水定容至25毫升。量取1.0毫升加無水乙醇5毫升，振盪均勻後靜置過夜，5000rpm離心15分鐘，棄去上清液，再加無水乙醇5毫升，靜置過夜後離心，沉澱物用去離子水溶解定容至10毫升為樣品液，備用。葡萄糖標準曲線的製作和總糖含量測定方法按《中國藥典》2010版一部靈芝項下完成。

2、總三萜物質的提取與含量測定

按靈芝中三萜類物質的含量測定標準DB44/T-496-2008中靈芝總三萜的測定方法，分別稱取0.5克赤芝（商購）子實體粉和0.5克白肉靈芝CCTCC M 2016087子實體粉於10毫升比色管中，加入10毫升無水乙醇搖勻，超音波（45千赫）處理1小時後，50℃水浴1小時，過濾後，提取液加蒸餾水定容至50毫升，取0.30毫升樣品溶液於60℃水浴蒸乾。香草醛-高氯酸法測定粗三萜含量，以齊墩果酸作為標準品。

3、數據處理

採用鄧肯氏新復極差檢驗法[利用Excel（2003）和SAS（Release 8.01）軟體]對數據進行分析。

赤芝（商購）子實體和白肉靈芝CCTCC M 2016087子實體的粗多糖含量和總三萜含量測定結果如表2所示。

表2：白肉靈芝與赤芝（商購）的主要有效成分

樣品	粗多糖（毫克/克）	總三萜（毫克/克）
白肉靈芝CCTCC M 2016087	1.7	1.23
赤芝（商購）	0.53	0.64

從表2發現，該發明的白肉靈芝CCTCC M 2016087的粗多糖與總三萜的含量遠高于于赤芝。此外，普通的靈芝子實體的粗多糖多在0.5-1.0毫克/克之間，總三萜多在0.6-0.8毫克/克之間，因此，該發明的白肉靈芝CCTCC M 2016087的粗多糖與總三萜的含量也遠高於普通靈芝品種，具有較高的有效成分。靈芝中粗多糖與總三萜的含量通常被作為其最主要的有效成分指標，用以評價該靈芝的藥用價值。這表明該白肉靈芝CCTCC M 2016087有效成分含量高，具開發潛力。

榮譽表彰