一種新型免疫原性複合物製劑及製備方法

《一種新型免疫原性複合物製劑及製備方法》是上海醫科大學於1993年4月22日申請的發明專利，該專利申請號為93112409，公布號為CN1093927A，專利公布日為1994年10月26日，發明人是聞玉梅、熊思東。該發明屬免疫調節製劑領域。

《一種新型免疫原性複合物製劑及製備方法》由抗原與抗體組建，抗原量多於抗體量，利用抗原抗體複合物為載體，攜帶抗原，改變抗原提呈形式，增強機體免疫性。該發明不加固體介質，可避免因固相介質引起的不良反應。對治療持續性病毒感染具有較好的效果。該發明製備方法簡便，實用。經過鴨B型肝炎病毒感染模型治療實驗有較好的效果。小鼠免疫應答實驗的抗體滴度較對照組高。

2010年11月15日，《一種新型免疫原性複合物製劑及製備方法》獲得第十二屆中國專利獎優秀獎。

基本介紹

• 中文名：一種新型免疫原性複合物製劑及製備方法
• 公布號：CN1093927A
• 公布日：1994年10月26日
• 申請號：93112409
• 申請日：1993年4月22日
• 申請人：上海醫科大學
• 地址：上海市醫學院路138號
• 發明人：聞玉梅、熊思東
• 代理機構：上海醫科大學專利事務所
• 代理人：吳桂琴
• Int.Cl.：A61K39/395
• 類別：發明專利

專利背景

醫學臨床研究表明構成持續性病毒感染（如慢性病毒性肝炎等疾病）的機理之一是機體缺乏有效的體液或細胞免疫。在臨床實踐中，對持續性病毒感染一般除採用抗病毒措施以外，常常需要增強機體的免疫應答。國內外現用的增強機體免疫治療製劑可歸納為（1）非特異性促進細胞免疫的製劑：如胸腺素、干擾素、轉移因子、白細胞介素等;（2）天然或合成的免疫增強藥物：如左旋咪唑，植物多糖，真菌或細菌的產物以及人工合成的模擬藥物;（3）調節免疫的激素：如強的松類藥物;（4）特異性抗體或特異性免疫核糖核酸；（5）疫苗（單獨使用或加化學試劑構成複合物或使聚集成小球體。上述幾類增強機體免疫治療製劑分別為非特異性增強劑或者僅為抗原（疫苗）或僅為抗體。迄今臨床上治療持續性病毒感染尚無抗原抗體複合物的製劑。1993年4月之前相關的研究有：

1.Fisher（專利號WO88/08429）的“免疫治療方法與組成”其中提到套用病毒的保護性抗原或相應的肽段與金葡菌，脂多糖或聚蔗糖（Ficoll）組成免疫可原用於治療愛滋病，但不是抗原抗體複合物製劑。

2.Randall（專利號：WO89/10755）的“免疫原性複合物及在預防接種的套用”用金葡菌CowanⅠ，或葡萄球菌A蛋白-Sepharose吸附作為載體，通過先吸附動物抗體為中介質，吸附一種或多種抗原可以組建成固相基質抗體抗原複合物同時需用固體作為介質。這一系統用於純化一種或多種抗原製備抗體，但未用於治療和調控持續性病毒感染。

發明內容

專利目的

《一種新型免疫原性複合物製劑及製備方法》的目的是提供一種由抗原與抗體組建成的具有較強免疫原性的複合物製劑及其製備方法。這種免疫原性複合物能增強機體的特異性體液與細胞免疫，可以用於對抗原（或相應病毒）的免疫應答低下或免疫耐受者及對常規疫苗接種無反應及反應低下者。

技術方案

《一種新型免疫原性複合物製劑及製備方法》的技術方案是採用特異抗原與抗體按一定比例結合，在抗原略過量的 情況下組建成新型有免疫原性的複合物製劑（IGC），利用抗原抗體複合物為載體，攜帶抗原，改變抗原提呈形式，達到增強免疫原性的目的，同時不用固體介質，可避免固相介質引起的不良反應。在機體免疫應答中，特異的抗原提呈是啟動機體的體液及細胞免疫應答的主要環節。利用抗原抗體複合物製成有免疫原性製劑的優點為（1），通過組建有免疫原性的複合物，較符生理條件下機體已經初次免疫後在抗原再次刺激下所引起的再次反應，故免疫應答較強，較快。（2）有免疫原性的複合物利用抗原抗體複合物為載體，一方面有利於有免疫原性的複合物與巨噬細胞或其他帶有FC受體細胞的接觸，另一方面又有利於有免疫原性的複合物與有抗原受體細胞的接觸，同時吸引數種免疫細胞，有利於誘導更強的特異性免疫應答（3）有免疫性的複合物還可有效地增強T細胞增殖方應。

該發明通過以下步驟製備新型有免疫原性的複合物製劑：（以B型肝炎病毒為例）（1）用自血源純化的B型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）（不經胃酶消化處理步驟以保存前S蛋白成份，以0.5-5微克/毫升蛋白量與抗B型肝炎病毒人免疫球蛋白（抗HBIg）（至少應為含200-400國際單位）0.5-5微克/毫升蛋白量組建有免疫原性的複合物製劑。

（2）將上述兩種成份分別自1∶100作5倍或10倍系列稀釋，經37共同孵育（30分鐘至2小時）後置4℃（12-20小時）。然後經12000轉/分離心30-80分鐘，吸出上清分別測定B型肝炎病毒表面抗原及抗B型肝炎病毒免疫球蛋白，以原始材料（純化B型肝炎病毒表面抗原，抗B型肝炎病毒免疫球蛋白）為對照比較。

（3）根據測定結果選擇最適比例管。

（4）將最適比例管的沉澱（抗原抗體複合物）懸浮於緩衝液中，加入氫氧化鋁作為佐劑作無菌，安全，毒性實驗，合格後，可作為試劑使用。

改善效果

《一種新型免疫原性複合物製劑及製備方法》能增強機體的特異性體液與細胞免疫，經初次和再次刺激，使機體免疫應答較強，較快。方法簡便，實用，對治療持續性病毒感染有較好的效果。

權利要求

1、一種有免疫原性的複合物，含有抗原和抗體，其特徵在於以抗原抗體複合物製劑為載體，攜帶抗原，增強免疫原性，用於治療病毒持續感染。

2、按權力要求1所述的有免疫原性的複合物，其特徵在於所說的抗原抗體的比例為抗原多於抗體，以保持免疫原性。

3、按權力要求1，2所述的有免疫原性的複合物，其特徵在於所說的抗原為B型肝炎表面抗原加前S蛋白，抗體為B型肝炎抗體免疫球蛋白。

4、一種按權力要求3所述的有免疫原性複合物製劑的製備方法，其特徵在於採用下列步驟完成：

（1）用自血源純化的B型肝炎表面抗原（不經胃酶消化處理步驟以保存前S蛋白成份）以0.5-5微克/毫升蛋白量與B肝抗體免疫球蛋白（至少應為含200-400國際單位）0.5-5毫克蛋白量進行組建有免疫原性複合物製劑。

（2）將上述兩種成份分別作不同稀釋（自1：100作5倍或10倍的系列稀釋），經37℃共同孵育（0.5-2小時）後，置4℃（12-20小時），然後經12000轉/分鐘離心30-60分鐘吸出上清，分別測定B肝表面抗原及抗B型肝炎病毒免疫球蛋白，以原始材料（純化B肝病毒表面抗原，B肝抗體免疫球蛋白）為對照比較。

（3）根據測定結果選擇最適比例管。

（4）將最適比例管的沉澱（抗原抗體複合物）懸浮於緩衝液中，加入氫氧化鋁作為佐劑，作無菌、安全、毒性試驗合格後，可作為製劑使用。

實施方式

（1）鴨B型肝炎病毒（DHBV）感染動物模型

（a）出殼一日齡雛鴨，用鴨B肝病毒脫氧核糖核酸（DHBV DNA）陽性血清100微升腹腔注射。每兩周用斑點酶免疫測定法及核酸雜交法檢測血清鴨B肝病毒脫氧核糖核酸及鴨B肝病毒表面抗原。以持續8周鴨B肝病毒脫 氧核糖核酸及鴨B肝病毒表面抗原均為陽性者作為已建立持續感染的動物模型。

（b）用純化的鴨B肝病毒表面抗原蛋白加弗氏（Freund）完全佐劑背部皮下免疫上述鴨，共免疫5次，上述鴨無體液免疫應答。采外周血分離單個核細胞（DPBL）作特異淋巴細胞增殖反應，結果上述鴨均無特異細胞增殖反應。

（c）用有免疫原性的複合物製劑免疫動物

取經純化的鴨B肝病毒表面抗原加入免疫抗鴨B肝病毒免疫球蛋白/前S蛋白抗體，混勻後，4℃過夜孵育，加弗氏（Freund）完全佐劑分別接種上述鴨，共3次。

結果：第2針後3周：50%鴨B肝病毒脫氧核糖核酸轉陰，50%鴨血清鴨B肝病毒表面抗原轉陰，有25%鴨產生抗體。

第3針後3周：仍為50%鴨鴨B肝病毒脫氧核糖核酸轉陰，50%鴨血清鴨B肝病毒表面抗原/前S蛋白轉陰，但有50%鴨產生抗體。

產生抗體鴨作淋巴細胞增殖實驗，反映有細胞免疫。

作為對照的未用有免疫原性的複合物免疫注射的鴨，鴨B肝病毒表面抗原，鴨B肝病毒脫氧核糖核酸均為陽性，血清未能測及抗體。

（2）小白鼠對有免疫原性的複合物製劑的免疫應答

材料與方法：（a）抗原：血源純化未經胃酶處理的B肝表面抗原及前S蛋白。

（b）抗體：B肝表面抗原抗體的人免疫球蛋白濃縮後按適當比例與抗原作用。

（c）37℃1小時後，4℃過夜，離心沉澱，將沉澱懸浮於緩衝液中，加入氫氧化鋁，腹腔注射免疫小鼠（0.1毫升/鼠），第一針免疫後21天採血，再次免疫後10天及21天採血。

（d）對照組為用抗原加氫氧化鋁免疫組及單抗原免疫組。

＊分子為抗體陽性數，分母為動物數，刮號內為抗體滴度

結果可見，抗原加抗體加氫氧化鋁所需B肝表面抗原減少而再次刺激後抗體滴度較對照組為高。

榮譽表彰

2010年11月15日，《一種新型免疫原性複合物製劑及製備方法》獲得第十二屆中國專利獎優秀獎。