《一種從豬脾臟中提取轉移因子的方法》是天津瑞普生物技術股份有限公司於2008年12月11日申請的專利，該專利的公布號為CN101475626，申請公布日為2009年7月8日，發明人是夏雪林、蘇建東、李旭東。該發明屬於獸藥領域。
《一種從豬脾臟中提取轉移因子的方法》包括組織、高壓均質機細胞破碎、絮凝劑沉澱、微孔濾膜過濾，超濾膜進行超濾等步驟。其中，破壁同時中加入了絮凝劑，使得溶液中的蛋白質沉澱，溶液變澄清，在超濾的過程中減少了堵塞中空纖維超濾柱的可能。該發明方法可縮短生產周期，節省了大量的人力物力，提高了轉移因子的生產效率，為滿足工業化大規模生產提供了可行途徑。
2015年11月27日，《一種從豬脾臟中提取轉移因子的方法》獲得第十七屆中國專利獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種從豬脾臟中提取轉移因子的方法
- 申請人：天津瑞普生物技術股份有限公司
- 申請日：2008年12月11日
- 申請號：2008101539964
- 公布號：CN101475626
- 公布日：2009年7月8日
- 發明人：夏雪林、蘇建東、李旭東
- 地址：天津市東麗開發區六經路6號
- 分類號：C07K1/34(2006.01)I、C07K1/30(2006.01)I
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
轉移因子（transferfactor，TF）是T淋巴細胞釋放的一種能夠轉移致敏信息的物質，它能夠特異地將供體的細胞免疫信息轉移給受體，從而增強受體的免疫功能。TF自50年代發現至今，中國國內外學者都對此進行大量研究，並於1979年將其引入到獸醫免疫和臨床治療中，2008年前其在中國國外已成為一種套用廣泛的增強免疫製劑。
由於轉移因子無種屬特異性，因此臨床上轉移因子的來源較為廣泛，人類臨床上常見的有人轉移因子、豬轉移因子、牛轉移因子、羊轉移因子、鵝、猴轉移因子等。2008年前畜禽上常見的有牛轉移因子、豬轉移因子，雞轉移因子。禽畜脾臟為加工過程中的廢物，因此有著極廣的套用開發前景，已成為轉移因子研究的熱點。
轉移因子為分子量小於10000，具有生物活性的非均一性的小分子混合物，其內含物包括游離胺基酸（16-18種），核酸、多肽及K、Na、Ca、Mg、Zn等金屬元素。各種TF內的理化特性，組成成分差異不大，但含量有較大差異。
從免疫學上，TF可分為特異性轉移因子和非特異性轉移因子兩大類。特異性轉移因子系採用某種特定病原感染或免疫人群、動物後再提取含該抗原特異活性的轉移因子，2008年前臨床已經套用有B型肝炎病毒特異轉移因子、各種腫瘤特異轉移因子、流行性出血熱病毒轉移因子、布氏菌轉移因子、皰疹病毒轉移因子、乙型腦炎轉移因子、結核菌轉移因子等。非特異性轉移因子是指用自然人群或動物白細胞提取的具有多種免疫活性的轉移因子，可非特異性調節機體的免疫機能，從而提高機體的抵抗力或疫苗的免疫效果。
細胞免疫主要通過T淋巴細胞實現，王建文等報導轉移因子能增強羅曼雛公雞T淋巴細胞的比值，馬風龍等研究發現將雞脾臟轉移因子與新城疫I系苗同時給肉雞注射可顯著提高淋巴細胞的轉化率，證明雞脾臟TF對雞的細胞免疫有促進作用，可促進T淋巴細胞的增殖與成熟，增強機體的細胞免疫應答能力。
早期經典的轉移因子機理研究試驗就發現轉移因子具有傳遞特異細胞免疫信息的活性，而抗原信息的刺激與動物機體免疫功能的發揮有著直接的聯繫。已有眾多資料證實，轉移因子可激活淋巴細胞E受體，增加E玫瑰花結的形成數目。因此免疫信息通過TF轉移給受體淋巴細胞，使細胞獲得這種免疫信息而產生識別特異性抗原的受體，當有該種抗原存在時，這種特異性識別受體就會與特異性抗原結合而觸發受體細胞活化，從增強淋巴細胞的活性而導致其高度分化增殖。
高迎春等研究報導雞注射TF後，接種減蛋綜合症滅活疫苗可以顯著提高雞體的抗體滴度。馬風龍等發現雞TF活疫苗和油乳劑滅活苗在首免和加強免疫時均具有協同作用，能顯著提高免疫接種雞的體液免疫應答能力，產生較高滴度的抗體，並延長抗體高峰期，使之維持較小時間。由於X淋巴細胞在實現體液免疫機能需要T淋巴細胞的輔助，2008年前普遍認為轉移因子對體液免疫的影響主要是通過T淋巴細胞調節機體的免疫機能。
劉潤珍等利用犬五聯疫苗免疫豬後製備特異性脾臟轉移因子，可以顯著增強小鼠E玫瑰花環形成率和腹腔巨噬細胞吞噬活性。陳德坤等研究發現，給健康小鼠注射和口服豬脾臟轉移因子可增強外周血液中性粒細胞對葡萄球菌的吞噬率和腹腔巨噬細胞對紅細胞的吞噬率。因此，轉移因子對機體的非特異性免疫機能也有增強作用。
范振青等研究發現，口服和注射TF可阻斷由氫化可的松引起的小鼠的白細胞數、淋巴細胞百分率及脾重指數的下降。苗乃法採用環磷醯胺建立的免疫抑制家兔模型進行豬脾轉移因子提升白細胞實驗，注射後第3天即可見白細胞總數迅速上升，第5天可達最高峰，第8天后趨向正常。由此推測TF作為免疫激活劑進入機體後，可使造血系統在短時間內產生大量的白細胞，同時活化淋巴細胞，增加T輔助細胞產生和釋放更多的淋巴因子，促進T淋巴細胞生長和分裂從而發揮抗放射、抗免疫抑制、增強免疫功能的作用。
王建文等報導雛雞口服0.5-1.0毫升轉移因子粗製品，7天后與未服用轉移因子組相比，增重明顯，且口服轉移因子組雞精神活潑，羽毛有光澤。江青艷等在試驗中發現，注射脾臟轉移因子對粵黃雞增重有明顯的效果。動物機體的正常生長發育一般由T3、T4和GH協同調控而完成。GH主要促進組織生長，T3、T4主要促進器官、組織的分化，而且，GH的促生長作用，需要有適量的T3、T4的存在。該試驗中，注射不同濃度的TF雞組在8周齡時血液T4，GH水平均顯著高於對照組，由此推斷脾臟轉移因子促進粵黃雞生長發育的內在機制與血液T4、GH水平的升高有關。
隨著現代化養殖規模化、集約化程度的不斷提高，2008年前病毒性疾病已成為困擾養殖戶的一大難題。2008年12月之前的普遍的解決方法就是免疫，然而由於種種原因，有時難免會造成免疫失敗，爆發非典型性傳染病，給診斷和治療帶來一定困難。在免疫失敗後往往依賴抗生素治療，造成了耐藥菌株的增加和交叉感染的產生。轉移因子作為一種細胞免疫發應增強劑，在防治疾病方面可發揮重要的作用，提高免疫後的免疫效果，有效提高機體的抗病能力。
2008年前的轉移因子技術，通常是將動物的脾臟中的脂肪和大血管剔出後，進行組織搗碎，反覆凍融後，通過半透膜透析獲得，操作費用高。另外，常規採用Laurence方法，即利用兩次透析法回收轉移因子此法操作簡單，但生產周期長工序繁瑣（生產周期約需要20天），耗時長，浪費大量人力物力。因此這些方法都難以進行工業化大規模生產。因此，需要一種快速、高效並且經濟的從動物脾臟中獲取轉移因子的方法，以滿足2008年前的工業化生產。
發明內容
專利目的
該發明目的在於提供一種從動物脾臟中獲取轉移因子的方法。
技術方案
《一種從豬脾臟中提取轉移因子的方法》包括：
1）將冷凍的動物脾臟1000克，用蒸餾水洗淨後切成小塊，加入1000毫升蒸餾水，用組織搗碎機絞碎；
2）高壓均質機（60兆帕）進行細胞破碎，同時加入絮凝劑加入1％絮凝劑240毫升；
3）在4℃下，以7000轉/分，離心15分鐘，去沉澱，留上清液；
4）上清液用微孔濾膜進行過濾，然後用超濾膜進行超濾，即為含有轉移因子的原液。
原液中含有預期的轉移因子，然後按照國家藥品管理辦法去除病毒後配製。在一個具體實施方案中，所述的蒸餾水是去熱原的蒸餾水。在另一個具體實施方案中，所述的絮凝劑是殼聚糖溶液。在另一個具體實施方案中，所述的微孔濾膜徑優選0.22微米。在另一個具體實施方案中，所述的超濾膜優選截留分子量為5000道爾頓的超濾膜。在另一個具體實施方案中，所述的動物是畜類，優選豬。
術語：“熱原”系指由微生物產生的能引起恆溫動物體溫異常升高的致熱物質。它包括細菌性熱原、內源性高分子熱原、內源性低分子熱原及化學熱原等。這裡所指的“熱原”，主要是指細菌性熱原，是某些細菌的代謝產物、細菌屍體及內毒素。致熱能力最強的是革蘭氏陰性桿菌的產物，其次是革蘭陽性桿菌類，革蘭陽性球菌則較弱，黴菌、酵母菌、甚至病毒也能產生熱原。熱原通常是磷脂多醇與蛋白質結合而成的複合物。磷脂多醇是複合物的活性中心，致熱作用最強。其化學組成因菌種不同而有所差異。分子量為5×104～5×105，分子量越大致熱作用也越強。
去熱原的方法包括：
1.高溫法：熱原的耐熱性能良好，60℃加熱1小時不被分解破壞，100℃不降解，但180℃3～4小時、200℃60分鐘或250℃30～45分鐘可使熱原徹底破壞。因此耐熱物品如玻璃製品、金屬製品、生產過程中所用的容器和其它用具以及注射時使用的注射器等，均可採用此法破壞熱原。但在通常使用的注射劑熱壓滅菌條件下不足以破壞熱原。
2.吸附法：熱原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由於活性炭性質穩定、吸附性強兼具助濾和脫色作用，故廣泛用於注射劑生產，但應注意吸附藥液所造成的主藥的損失。
3.超濾法：熱原分子量為1×10左右，體積較小，約1～5納米，可以通過一般濾器和微孔濾膜，但採用超濾法如用3.0～15納米超濾膜可將其除去。
4.蒸餾法：熱原能溶於水但不揮發，但可隨水蒸氣的霧滴進入注射用水中，因此製備注射用水時，原水中的熱原可經蒸餾除去，但需多次蒸餾，，並加有隔沫裝置，單次蒸餾往往效果不理想。
5.酸鹼法：熱原能被強酸、強鹼、強氧化劑破壞。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、輸液瓶等可用重鉻酸鉀硫酸清潔液或稀氫氧化鈉處理，破壞熱原。
6.其它：包括離子交換法、凝膠濾過法、反滲透法等。
有益效果
1.該發明在提取過程中，破碎後使用高壓均質機再次進行破壁，使得組織或細胞內容物充分被釋放；
2.在破壁同時中加入了絮凝劑，使得溶液中的蛋白質沉澱，溶液變澄清，在超濾的過程中減少了堵塞中空纖維超濾柱的可能；
3.採用該發明生產轉移因子，生產周期縮短，使得按傳統反覆凍融的方法進行細胞破壁、半透膜進行透析的方法，生產周期縮短20天左右；而採用該發明方法製備的轉移因子生產周期只需要7天左右，節省了大量的人力物力；
4.提高了轉移因子的生產效率，傳統反覆凍融的方法進行細胞破壁、半透膜進行透析的方法，生產的轉移因子原液，每1000克脾臟約生產含量為2.0毫克/毫升左右的原液2000毫升，而採用該發明生產每1000克脾臟約生產含量為7.0毫克/毫升左右的原液1000毫升，折合產量增加175％。
權利要求
1.《一種從豬脾臟中提取轉移因子的方法》包括：
1）將冷凍的動物脾臟1000克，用蒸餾水洗淨後切成小塊，加入1000毫升蒸餾水，用組織搗碎機絞碎；
2）高壓均質機（60兆帕）進行細胞破碎，同時加入絮凝劑加入1％絮凝劑240毫升；
3）在4℃下，以7000轉/分，離心15分鐘，去沉澱，留上清液；
4）上清液用微孔濾膜進行過濾，然後用超濾膜進行超濾，即為含有轉移因子的原液。
2.權利要求1的方法，其中所述的蒸餾水是去熱原的蒸餾水。
3.權利要求1或2的方法，其中所述的絮凝劑是殼聚糖溶液。
4.權利要求1至3中任一項的方法，其中所述的微孔濾膜徑優選0.22微米。
5.權利要求1至4中任一項的方法，其中所述的超濾膜優選截留分子量為5000道爾頓的超濾膜。
6.權利要求1至5中任一項的方法，其中所述的動物是畜類，優選豬。
實施方式
實施例1：轉移因子的製備
1、剪摘、清洗：將融化為半凍態的動物脾臟去除脂肪和血管，精確稱量1千克，用無熱源蒸餾水水清洗3遍。
2、絞碎：除脂後的脾臟稱取絞肉機內初絞3遍，將絞碎的脾臟中加入500毫升無熱源蒸餾水，放入搗碎缸，精絞。
3、研磨：將搗碎的脾漿放入膠體磨中將其研磨，製成勻漿。
4、細胞破碎：將上述脾勻漿，於高壓均質機內，壓力60兆帕進行均質，製成勻漿。
5、將高壓均質好的勻漿加入1％殼聚糖溶液240毫升，置冷凍離心機中，7000轉/分，離心15分鐘，離心環境溫度4℃，棄去沉渣，收集上清液。
6、上清液用0.22微米的微孔濾膜進行過濾，然後用截留分子量為5000道爾頓超濾膜進行超濾，即為原液。
實施例2：對該發明所述工藝製備的轉移因子的檢測
對實施例1所述工藝製備的轉移因子原液按照國家藥品監督管理局、國家藥品標準WS1-X6-036-2000進行以下檢測：
1、外觀性狀為微黃色澄明液體，符合轉移因子溶液的外觀性狀。
2、胺基酸鑑別反應為正反應。
3、紫外分光光度測定：上述所得樣品在251±2納米處有一吸收峰，且ABS250/ABS280>2.0。
4、pH值在6.0~7.5之間。
5、20％磺基水楊酸檢測：上述所得樣品無渾濁及沉澱現象，說明蛋白反應均成陰性，其不含大分子蛋白質。
6、高分子量物質檢測，在胰島素出峰時間之前無吸收峰，說明該品中無高於分子量6000的大分子。
7、游離胺基酸檢測：每1毫升中該品胺基酸含量10毫克。
7、轉移因子活性測定：根據轉移因子可使脫E受體後的胸腺T細胞恢復其受體功能，從而反應轉移因子的生物活性。上述所得樣品形成E玫瑰花結的百分率分別為31.2％、29.6％，比對照組分別增加17.8％、16.9％（P≤0.01）。
8、細菌學檢驗：上述所得樣品中無需氧、厭氧、腐生菌和真菌存在。
9、過敏性、毒性試驗：取健康小白鼠10隻，雌雄各半，口服該品濃縮液，相當於正常口服劑量的100倍，觀察小白鼠的生存能力的變化，結果：無任何過敏、毒性反應，也無任何死亡出現，說明該品是安全的，無任何毒性和副作用。
10、核酸含量測定：上述所得樣品經地衣酚法測定核酸含量分別為621.05微克/毫升、599.89微克/毫升。
11、多肽含量測定：上述所得樣品經Lowry法測定多肽含量分別為：7.12毫克/毫升、6.98毫克/毫升。
12、用豬偽狂犬病病毒抗原做皮試檢測，有弱的陽性反應，說明該品具有良好的轉移活性和特異性。
通過上述實施例，我們發現所提取的豬脾臟轉移因子含量高，生產工序簡單，生產效率高。同時所生產轉移因子原液符合國家法典的標準規定。因此該發明所採用的生產方法可以進行大規模的生產推廣。
榮譽表彰
2015年11月27日，《一種從豬脾臟中提取轉移因子的方法》獲得第十七屆中國專利獎優秀獎。
