一種優良食味水稻的育種方法

《一種優良食味水稻的育種方法》是江蘇省農業科學院於2008年4月2日申請的專利，該專利的申請號為2008100232164，公布號為CN101268757，授權公布日為2008年9月24日，發明人是王才林、陳濤、張亞東、朱鎮、趙凌、林靜，該發明屬水稻遺傳改良與生物技術套用領域。

《一種優良食味水稻的育種方法》涉及一種優良食味水稻的育種方法，屬水稻遺傳改良與生物技術套用領域。選用江蘇高產粳稻品種武香粳14與優質粳稻品種關東194雜交配組；F₄開始選擇單株；F₅開始進行分子標記輔助選擇，獲得農藝性狀穩定一致的優良食味品種南粳46，其暗胚乳突變基因型為Wx－mqWx－mq。育成攜帶該突變基因位點的水稻品種南粳46其胚乳外觀呈雲霧狀、乳白色，透明度略差，其米飯質地粘軟，表面光澤透亮，綜合了糯米的柔性和粳米的彈性，冷飯不硬，食味品質極佳。在江蘇、上海、浙江等晚粳稻地區具有廣闊的套用前景。

2013年，《一種優良食味水稻的育種方法》獲得第八屆江蘇省專利項目獎優秀獎。

（概述圖為《一種優良食味水稻的育種方法》摘要附圖）

基本介紹

• 中文名：一種優良食味水稻的育種方法
• 公布號：CN101268757
• 公布日：2008年9月24日
• 申請號：2008100232164
• 申請日：2008年4月2日
• 申請人：江蘇省農業科學院
• 地址：江蘇省南京市鐘靈街50號,江蘇省農科院科技處張初賢
• 發明人：王才林、陳濤、張亞東、朱鎮、趙凌、林靜
• Int.Cl.：A01H1/02（2006.01）、A01H1/04（2006.01）、A01H5/00（2006.01）、C12Q1/68（2006.01）、C12N15/11（2006.01）
• 代理機構：南京經緯專利商標代理有限公司
• 代理人：張素卿
• 類別：發明專利

專利背景

稻米品質作為水稻育種的重要目標之一，越來越受到育種工作者與消費者的關注。2000年以來，江蘇省粳稻育種的目標從高產、優質、多抗轉向優質、高產、多抗，優質成為江蘇省粳稻育種的首要目標。因此，各育種單位都十分重視稻米品質的改良，注意選用優質材料作為雜交育種的親本，在分離世代中加強對稻米品質的篩選鑑定，取得了顯著成就。2000-2008年育成國標三級以上的優質粳稻新品種（組合）數逐年上升，共育成56個優質粳稻新品種（組合）。然而，這些品種在生產上的推廣套用面積並不大。據統計，2006年在生產上年推廣套用面積在50萬畝以上的品種只有徐稻3號、武粳15、徐稻4號、寧粳1號、鎮稻99、武運粳7號、武香粳14、武粳13、鹽稻8號、揚輻粳7號等。相反，武育粳3號雖然品質達不到國標三級優質稻穀標準，但在生產上的推廣套用面積仍然較大。究其原因，多數品種的食味品質不能滿足消費者的需求是主要原因之一。分析56個品質達國標三級優質稻穀標準以上粳稻品種的品質狀況可知，品質達國標一級的粳稻品種僅8個，達國標二級的粳稻品種（組合）也只有17個。尤其是食味品質欠佳，缺乏在國際市場上具有競爭力的優質品種，這已成為制約江蘇省優質粳稻產業發展的一個主要因素。

研究表明，澱粉中直鏈澱粉的相對含量是決定米飯質地和食味的重要因素。直鏈澱粉含量低，米飯粘軟，外觀油潤，有光澤，冷不回生，適口性好；反之，則米飯質地硬，粘性小，蓬鬆乾燥，光澤差（Zhu CL，et al.Sci Agric Sin.2004，3（2）：81-88）。暗胚乳突變是水稻低直鏈澱粉突變的主要類型，攜帶該突變位點的水稻品種其胚乳外觀呈雲霧狀、乳白色，透明度略差，其米飯質地粘軟，表面光澤透亮，綜合了糯米的柔性和粳米的彈性，冷飯不硬，食味品質極佳。

日本歷來重視稻米品質，生產上推廣的粳稻品種如“越光”等，無論外觀品質或食味品質均堪稱一絕。日本水稻育種家已利用暗胚乳突變基因育成了大量食味品質優良、直鏈澱粉偏低的水稻品種，如關東194、Milky Queen和New-hikari等（Sato Metal.JpnJBreed，1996，46（supp.1）：221；Tomit Ketal.Bull Fukui Agr Exp Sta Series，2007，44：1-20.）。因此，利用日本優質粳稻資源改良江蘇高產粳稻的品質，是一條值得探索的途徑。發明一種高效的暗胚乳突變基因的轉育與選擇鑑定方法，聚合抗病、優質、高產基因於一體，是《一種優良食味水稻的育種方法》的宗旨。

發明內容

專利目的

技術問題《一種優良食味水稻的育種方法》涉及一種優良食味水稻培育方法，採用高效的暗胚乳突變基因的轉育與選擇鑑定方法，聚合抗病、優質、高產基因於一體，獲得優良食味水稻品種。

技術方案

《一種優良食味水稻的育種方法》特徵在於：

1）選用Wx位點上基因型為Wx-bWx-b的江蘇高產粳稻品種武香粳14為母本（♀）與暗胚乳突變基因型為Wx-mqWx-mq的優質粳稻品種關東194為父本雜交配組（其中Wx-mq相對於Wx-b為隱性遺傳）；

2）種植F₁、F₂、F₃，成熟後全部單株混收；

3）F₄開始選擇株高100～110厘米、每株8～10穗、每穗130～150粒的單株；

4）F₅開始進行分子標記輔助選擇，各世代在農藝性狀穩定的小區移栽後30天採取單株葉片2～3片，用SDS法提取DNA，用CAPS標記序列進行PCR擴增：

正向序列為TGTGGCTGAGGTAGGAGCA，

反向序列為AACGCATCTGGTTGTCTTTGT；

PCR反應體系：模板DNA10納克/微升1微升；引物對4皮摩爾/微升0.8微升；10×緩衝液1微升；MgCl₂（25毫摩爾/升）0.6微升；dNTP（2.5毫摩爾/升）0.2微升；Taq酶5U/微升0.1微升；ddH₂O6.3微升；反應總量10微升。PCR反應在MJReseachPTC-200熱循環儀上進行，反應程式包括：94℃預變性5分鐘，每個循環94℃變性30秒，52.2℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環，最後72℃延伸7分鐘，12℃保存；

酶切體系：PCR擴增產物2微升；NIaIII酶2微升（10U）；10×NEBBuffer42微升；100×BSA0.2微升；ddH₂O13.8微升；反應總量20微升；酶切反應在MJReseachPTC-200熱循環儀上進行，37℃恆溫4小時；酶切產物在1％瓊脂糖上進行分離鑑定1小時（180V），溴化乙錠染色，然後在紫外凝膠成像儀上觀察並拍照。酶切產物電泳檢測顯示有215bp和170bp兩條譜帶的為Wx-mq基因純合體的水稻品種，據此確認暗胚乳突變基因型為Wx-mqWx-mq小區。

5）F₅開始只在基因型為Wx-mqWx-mq的小區選擇株高100～110厘米、每株8～10穗、每穗130～150粒的單株。F₇代獲得農藝性狀穩定一致的優良食味品種南粳46，其暗胚乳突變基因型為Wx-mqWx-mq，株高105～110厘米，每株8～10穗，穗長16厘米，直立穗型，每穗總粒數140～150粒，結實率90％左右，千粒重25～26克。

有益效果

通過《一種優良食味水稻的育種方法》方法可快速鑑定出帶暗胚乳突變基因Wx-mq的單株，大大提高選擇效率，縮短育種年限。

由此育成的水稻新品種南粳46，其暗胚乳突變基因型為Wx-mqWx-mq，株高105～110厘米，每株8～10穗，穗長16厘米，直立穗型，每穗總粒數140～150粒，結實率90％左右，千粒重25～26克。米飯質地粘軟，表面光澤透亮，綜合了糯米的柔性和粳米的彈性，冷飯不硬，食味品質極佳。

該發明方法育成的新品種聚合了雜交親本雙方的優良食味、抗條紋葉枯病、高產等特性，在江蘇、上海、浙江等晚粳稻地區具有廣闊的套用前景。

附圖說明

圖1是優良食味品種南粳46（左）與一般優質粳稻品種（右）的比較，前者胚乳外觀呈雲霧狀、乳白色，透明度略差，後者透明度好；

圖2是“南粳46”選育系譜圖；

圖3是CAPS標記電泳檢測後代株系的Wx-mq基因型；（M：DNA分子量標準100bpladder；第1泳道為：不含Wx-mq基因的株系；第2，3泳道為：Wx-mq基因雜合體的株系；第4-8泳道：Wx-mq基因純合體的株系）。

權利要求

1、《一種優良食味水稻的育種方法》特徵在於：

1）選用Wx位點上基因型為Wx-bWx-b的江蘇高產粳稻品種武香粳14為母本（♀）與暗胚乳突變基因型為Wx-mqWx-mq（Wx-mq相對於Wx-b為隱性遺傳）的優質粳稻品種關東194為父本雜交配組；

2）種植F₁、F₂、F₃，成熟後全部單株混收；

3）F₄開始選擇株高100～110厘米、每株8～10穗、每穗130～150粒的單株；

4）F₅開始進行分子標記輔助選擇，各世代在農藝性狀穩定的小區移栽後30天採取單株葉片2～3片，用SDS法提取DNA，用CAPS標記序列進行PCR擴增：

正向序列為TGTGGCTGAGGTAGGAGCA，

反向序列為AACGCATCTGGTTGTCTTTGT；

PCR反應體系：模板DNA10納克/微升1微升；引物對4皮摩爾/微升0.8微升；10×緩衝液1微升；MgCl₂25毫摩爾/升0.6微升；dNTP2.5毫摩爾/升0.2微升；Taq酶5U/微升0.1微升；ddH₂O6.3微升；反應總量10微升；PCR反應在MJReseachPTC-200熱循環儀上進行，反應程式包括：94℃預變性5分鐘，每個循環94℃變性30秒，52.2℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環，最後72℃延伸7分鐘，12℃保存；酶切體系：PCR擴增產物2微升；10UNIaIII酶2微升；10×NEBBuffer42微升；100×BSA0.2微升；ddH₂O13.8微升；反應總量20微升；酶切反應在MJReseachPTC-200熱循環儀上進行，37℃恆溫4小時；酶切產物在1％瓊脂糖上進行分離鑑定180V1小時，溴化乙錠染色，然後在紫外凝膠成像儀上觀察並拍照；酶切產物電泳檢測顯示有215bp和170bp兩條譜帶的為Wx-mq基因純合體的水稻品種，據此確認暗胚乳突變基因型為Wx-mqWx-mq的小區；

5）F₅開始只在基因型為Wx-mqWx-mq的小區選擇株高100～110厘米、每株8～10穗、每穗130～150粒的單株，F₇代獲得農藝性狀穩定一致的優良食味品種南粳46，其暗胚乳突變基因型為Wx-mqWx-mq，株高105～110厘米，每株8～10穗，穗長16厘米，直立穗型，每穗總粒數140～150粒，結實率90％～92％，千粒重25～26克。

實施方式

選擇親本武香粳14，江蘇高產粳稻品種，江蘇省武進區稻麥育種場育成，2003年審定定名。Wx位點基因型為Wx-bWx-b。該品種全生育期156天，株高98～102厘米，每株有效穗8～10個，每穗實粒數110～120粒，結實率92％～93％，千粒重25～26克。

關東194，優良食味的優質粳稻品種（日本引進），日本茨城縣育成，2003年農林水產省登錄，登錄名為農林387號。優良食味，Wx位點基因型為Wx-mqWx-mq，該品種全生育期130～135天，株高85～95厘米，每株有效穗6～8個，每穗實粒數100～110粒，結實率93％～95％，千粒重24～25克。

品種選育1999年在海南選用江蘇高產粳稻品種武香粳14（原名99-15，Wx位點基因型為Wx-bWx-b）為母本（♀）與引進的優良食味的優質粳稻品種關東194（Wx位點基因型為Wx-mqWx-mq）為父本雜交配組。2000年在南京種植F₁組合，同年冬在海南種植F₂，成熟後全部單株混收，2001年在南京種植F₃，成熟後全部單株混收種成小區。

2002年（F₄）開始選擇株高100～110厘米、每株8～10穗、每穗130～150粒的單株。此後（2003～2005年）每年在南京種植各世代（F₅～F₇）株系，單株選擇材料每年正季種植於江蘇省農業科學院糧食作物研究所試驗田（南京），5月15～18日播種，6月15～18日移栽。每個株系種植40～50株，2行或4行區，行株距17厘米×17厘米，小區間空1行。田間管理按常規方法進行。

分子標記輔助選擇F₅開始進行分子標記輔助選擇，各世代在農藝性狀穩定的小區移栽後30天在農藝性狀穩定的小區採取單株葉片，用SDS法提取DNA（DellaportaSL，WoodJ，HicksJB.Aplant DNA分鐘ipreparation：VersionII.Plant Mol Biol Rep，1983，1（1）：19～21）。利用CAPS標記序列（正向序列為TGTGGCTGAGGTAGGAGCA，反向序列為AACGCATCTGGTTGTCTTTGT）進行PCR擴增。

PCR反應體系：模板DNA10納克/微升1微升；引物對4皮摩爾/微升0.8微升；10×緩衝液1微升；MgCl₂（25毫摩爾/升）0.6微升；dNTP（2.5毫摩爾/升）0.2微升；Taq酶5U/微升0.1微升；ddH₂O6.3微升；反應總量10微升。PCR反應在MJ ReseachPTC-200熱循環儀上進行，反應程式包括：94℃預變性5分鐘，每個循環94℃變性30秒，52.2℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環，最後72℃延伸7分鐘，12℃保存。

酶切體系：PCR擴增產物2微升；NIaIII酶2微升（10U）；10×NEBBuffer42微升；100×BSA0.2微升；ddH₂O13.8微升；反應總量20微升；酶切反應在MJReseachPTC-200熱循環儀上進行，37℃恆溫4小時；酶切產物在1％瓊脂糖上進行分離鑑定1小時（180V），溴化乙錠染色，然後在紫外凝膠成像儀上觀察並拍照。酶切產物電泳檢測顯示Wx-mq基因純合體的水稻品種有215bp和170bp兩條譜帶；Wx-mq基因雜合體的水稻品種有385bp、215bp和170bp三條譜帶；不含Wx-mq基因的水稻品種僅有385bp一條譜帶（圖3）。

通過分子標記輔助選擇，確認暗胚乳突變基因型為Wx-mqWx-mq的小區。F₅開始只在基因型為Wx-mqWx-mq的小區選擇株高100～110厘米、每株8～10穗、每穗130～150粒的單株。2005年（F₇）獲得條紋葉枯病抗性穩定、農藝性狀一致的優質、高產、優良食味品種南粳46，其暗胚乳突變基因型為Wx-mqWx-mq，株高98～102厘米，每株8～10穗，穗長16厘米，直立穗型，每穗總粒數140～150粒，結實率90％～92％，千粒重25～26克。該水稻新品種米飯質地粘軟，表面光澤透亮，綜合了糯米的柔性和粳米的彈性，冷飯不硬，食味品質極佳。

序列表

<110>江蘇省農業科學院

<120>一種優良食味水稻的育種方法

<130>說明書

<140>00

<141>2008-03-16

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>水稻暗胚乳突變基因Wx-mq的分子標記引物正向序列

<222>（1）..（19）

<223>

<400>1

tgtggctgag gtaggagca19

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>水稻暗胚乳突變基因Wx-mq的分子標記引物反向序列

<222>（1）..（21）

<223>

<400>2

aacgcatctg gttgtctttg t

榮譽表彰

2013年，《一種優良食味水稻的育種方法》獲得第八屆江蘇省專利項目獎優秀獎。