《一株能以多碳源共發酵的釀酒酵母及其套用》是江南大學於2014年10月30日申請的發明專利，該專利的申請號為2014106052531，公布號為CN104371937A，公布日為2015年2月25日，發明人是徐岩、吳群，該專利屬於微生物技術領域和發酵工程技術領域。
《一株能以多碳源共發酵的釀酒酵母及其套用》所述釀酒酵母CCTCC M 2014463菌株是從中國醬香型白酒釀造酒醅中分離得到。該菌株可以利用葡萄糖、半乳糖、木糖和阿洛酮糖，蔗糖、麥芽糖、蜜二糖、松二糖、海藻糖，棉子糖，並且可以同時利用葡萄糖和以上的其它糖。同時，該酵母能夠耐受高溫、高乙醇和高酸，並產生酸類、醇類、酯類和苯乙醛、苯乙酮4-乙烯基愈瘡木酚等多種風味物質。該酵母可以直接用於生產飲料酒、飲料酒生產中釀酒酵母的強化、以及澱粉質和纖維素糖化後作為碳源底物的燃料乙醇的生產，能夠顯著提高碳源利用率和乙醇得率。
2018年12月20日，《一株能以多碳源共發酵的釀酒酵母及其套用》獲得第二十屆中國專利銀獎。
基本介紹
- 中文名：一株能以多碳源共發酵的釀酒酵母及其套用
- 公布號：CN104371937A
- 公布日：2015年2月25日
- 申請號：2014106052531
- 申請日：2014年10月30日
- 申請人：江南大學
- 地址：江蘇省無錫市蠡湖大道1800號
- 發明人：徐岩、吳群
- 分類號：C12N1/18（2006.01）I、C12G3/02（2006.01）I、C12P7/10（2006.01）I、C12R1/865（2006.01）N
- 代理機構：北京愛普納傑專利代理事務所（特殊普通合夥）
- 類別：發明專利
- 代理人：張勇
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,生物材料保藏,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae MT1可以利用糖來產生乙醇，被套用於工業釀造已有幾千年的歷史，包括各類飲料酒的生產，如白蘭地、威士忌、伏特加、金酒、朗姆酒、中國白酒、葡萄酒、黃酒、啤酒等。同時，隨著石油資源的枯竭，以及燃料乙醇生產資源的可再生性，人類開始利用釀酒酵母生產燃料乙醇。因此，釀酒酵母對人類社會的發展是極其重要的。然而，釀酒酵母在生產套用中存在以下三個方面的問題：
第一、不論是對於採用穀物類為原料的飲料酒釀造，還是以纖維素和澱粉為原料的燃料乙醇的生產，由於釀酒酵母不能直接利用纖維素和澱粉等聚合物原料，必須首先將上述多糖降解為單糖才能被酵母所使用。但是，由於纖維素和澱粉降解產生糖種類具有多樣性，如木質纖維素類生物質（如農作物秸稈、穀殼、麩皮、蔗渣、林木、林業加工廢棄物、草類等），水解（用酸法或酶法）後可生成葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖以及其它寡糖等成分；澱粉質原料水解後可生產葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽糖、潘糖及其它寡糖等成分。這種糖的多樣性並不利於釀酒酵母的發酵。首先，釀酒酵母利用糖存在葡萄糖效應，也就是當其它糖與葡萄糖共存時，釀酒酵母只能利用葡萄糖，只有當葡萄糖利用完之後，才能開始利用其它可利用的糖；其次，釀酒酵母一般只能利用葡萄糖，麥芽糖、果糖等少數糖類，以上特點限制了釀酒酵母對各種糖類的使用，不僅使得產酒率降低，而且造成碳源利用效率的降低，以及資源利用率的降低，造成極大的資源浪費。
為解決以上問題，2014年10月前研究者開展大量工作，包括尋找具有多碳源利用能力的酵母等。但是，一般野生酵母都不具備多碳源利用的能力，因此，要採用基因工程方法構建多碳源利用的酵母。例如原生質體融合、外源基因導入或關鍵基因敲除等方法。有研究報導，採用基因工程技術重組後的釀酒酵母可共發酵葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖等。但是由於基因工程菌導入基因有限，利用糖的種類仍然有限；同時，由於釀酒酵母為單雙倍體共存的菌株，菌株功能不穩定是基因工程菌使用的最大障礙；並且基因改造的方法在飲料酒釀造生產中使用是不被認可的。
第二、在釀酒過程及燃料乙醇發酵過程中，釀造環境極其複雜，對於燃料乙醇的生產，釀酒酵母只有具有高濃度乙醇的耐受能力才能更有效的發酵生產乙醇；而在釀酒過程中，除了要求釀酒酵母能夠耐受高濃度乙醇外，還需要其具有耐受酸性、以及高溫的能力。因此，只有釀酒酵母具有耐受以上脅迫條件等能力，才能發揮高效的發酵能力。然而，常規使用的釀酒酵母只能耐受8％乙醇、37℃溫度、pH3.0。
第三、對於飲料酒的釀造，不僅要求釀酒酵母具有高效的發酵能力，還要求其具有良好的風味代謝能力，使得飲料酒具有更多樣的風味組成。
以上特點對飲料酒與燃料乙醇等產業中釀酒酵母菌種的要求提出了3個方面的要求，但是由於2014年10月前技術的有限，以及野生酵母自身存在的缺陷，仍然要求在菌種方面需要重要突破。
發明內容
專利目的
《一株能以多碳源共發酵的釀酒酵母及其套用》提供一株能以多碳源共發酵的釀酒酵母及其套用，該酵母是從中國醬香型白酒釀造環境中篩選獲得的，具有多碳源利用、耐受高溫、耐高酸、耐高乙醇濃度以及豐富的風味代謝能力等特徵，能夠套用於飲料酒釀造、燃料乙醇生產等領域。該發明的第一個目的是提供一株釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae MT1，該發明的第二個目的是提供所述釀酒酵母的套用方法。
技術方案
《一株能以多碳源共發酵的釀酒酵母及其套用》的第一個目的，其特徵在於，所述釀酒酵母於2014年10月10日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M 2014463。
所述釀酒酵母篩選自醬香型白酒釀造環境，經26srDNA序列鑑定為釀酒酵母，其26srDNA序列如SEQ ID NO.1所示，該序列在NCBI上blast比對後，與2014年10月前已有釀酒酵母序列相似度是99％。
所述釀酒酵母在YPD培養基上生長，菌落為白色，圓形，邊緣整齊，表面光滑。
所述釀酒酵母在電子顯微鏡下的形態如圖1所示，可以看出釀酒酵母的細胞為球形或者橢球形，頂端芽痕說明其繁殖的方法為出芽生殖。
所述釀酒酵母能利用以下任意一種碳源：葡萄糖、半乳糖、木糖、阿洛酮糖、蔗糖、麥芽糖、蜜二糖、松二糖、海藻糖、棉子糖及其它寡糖。
所述釀酒酵母能利用上述一種或者兩種以上的混合碳源，來生產乙醇。
所述釀酒酵母能夠耐受高溫（44℃），耐酸（pH2.0），耐酒精（16％）。
該發明的第二個目的，所述套用方法，是將釀酒酵母直接用於生產飲料酒，以穀物類原料經過糖化後的含有多糖組成的液體或固體基質為底物，以及水果類釀造原料，發酵生產飲料酒。
所述飲料酒包括：白蘭地、威士忌、伏特加、金酒、朗姆酒、中國白酒、特基拉、葡萄酒、黃酒、啤酒、燒酒、清酒等。其中威士忌、勁酒、伏特加、特基拉、中國白酒、黃酒、啤酒、燒酒、清酒，這些酒的釀造主要使用穀物（植物）類原料，在釀造之前原料（小麥、玉米、裸麥、大麥、馬鈴薯、高粱、豌豆、甘薯、大米、糯米）需要經過糖化，該發明的釀酒酵母能夠以糖化後所得的含有多糖組成的液體或固體基質為底物，或者水果類釀造原料為底物，發酵生產飲料酒，能夠提高碳源利用率和產酒率。
所述套用方法，還可以是所述釀酒酵母在飲料酒生產中的強化套用，採用液體菌劑或固體菌劑的方式接種於生產體系中，提高碳源利用率和產酒率。
所述液體菌劑製作方式：將活化的種子液按1～5％（w/w）的接種量（即每100克液態培養基接種種子液1-5克）接種於滅菌的液態培養基中，25～35℃培養24小時～72小時。
所述液態培養基，在該發明的一種實施方式中為高粱提取物培養基，製作方法為：20～200克高粱樣品經粉碎後，加毫升/克計1～4倍的水，蒸煮1-5小時，呈糊狀，冷卻後加入10～50單位/克的糖化酶，於40～100℃保持2～10小時，過濾、離心所得濾液，糖度為10～15°Bx。
所述固體菌劑的製作方式：將活化的種子液接種（一級種子）高粱培養基中（接種量為1～5％，w/w），在25～35℃環境中固態發酵32～72小時，製成固態菌製劑。
所述套用方法，還可以是將釀酒酵母CCTCCM2014463用於燃料乙醇的生產，是將所述釀酒酵母接種於以澱粉質原料和纖維素原料經過糖化後的含有多糖組成的液體或固體基質中，發酵生產燃料乙醇，提高碳源利用率和乙醇得率。
所述澱粉質原料，包括各種穀物（植物）原料。
所述纖維素原料，包括木質纖維素類生物質（如農作物秸稈、穀殼、麩皮、蔗渣、林木、林業加工廢棄物、草類等）。
改善效果
《一株能以多碳源共發酵的釀酒酵母及其套用》的釀酒酵母是從中國醬香型白酒釀造環境中篩選獲得的，由於醬香型白酒釀造屬於同步糖化發酵過程，使得該體系中含有多樣不同碳源組成，並且該系統具有高溫、高酸、高乙醇濃度等特徵，賦予了該酵母具有多碳源利用、以及耐受高溫、高酸及高乙醇濃度的特徵，並且該釀酒酵母具有豐富的風味代謝能力。該發明的酵母是首次發現的同時具有上述優良的釀造特徵的釀酒酵母，使得該釀酒酵母不論對於飲料酒釀造還是對於燃料乙醇釀造都具有非常重要的套用潛力與價值。
生物材料保藏
釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae CCTCC NO:M 2014463，分類學命名為Saccharomyces cerevisiae MT1，於2014年10月10日保藏於中國典型培養物保藏中心（CCTCC），保藏地址為武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M 2014463。
附圖說明
圖1：釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463的電鏡照片；
圖2：釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463與釀酒酵母模式株S288C多碳源利用能力的比較，圖中*代表顯著性差異（one-wayANOVA分析P<0.05）；
圖3：釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463與釀酒酵母模式株S288C耐受溫度、pH、乙醇脅迫的比較，圖中*代表顯著性差異（one-wayANOVA分析P<0.05）；
圖4：釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463風味代謝產物GCMS譜圖。
圖5：菌株於以葡萄糖為碳源的培養基中的發酵情況，其中實心圖示代表釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463、空心圖示代表對照菌株釀酒酵母S288c；
圖6：菌株於以葡萄糖、麥芽糖為混合碳源的培養基中的發酵情況，其中實心圖示代表釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463、空心圖示代表對照菌株釀酒酵母S288c；
圖7：菌株於以葡萄糖、半乳糖為混合碳源的培養基中的發酵情況，其中實心圖示代表釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463、空心圖示代表對照菌株釀酒酵母S288c。
權利要求
1.一株釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，其特徵在於，所述釀酒酵母於2014年10月10日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學，保藏編號為CCTCC M 2014463。
2.權利要求1所述釀酒酵母在食品領域的套用。
3.權利要求1所述釀酒酵母在釀酒技術領域的套用。
4.根據權利要求3所述的套用，其特徵在於，是將所述釀酒酵母直接用於生產飲料酒，以穀物類原料經過糖化後的含有多糖組成的液體或固體基質為底物，以及水果類釀造原料，發酵生產飲料酒，能夠利用各種多糖組分，提高原料利用率和產物產率。
5.根據權利要求3所述的套用，其特徵在於，是將所述釀酒酵母在飲料酒生產中的強化套用，採用液體菌劑或固體菌劑的方式接種於生產體系中。
6.權利要求1所述釀酒酵母在燃料乙醇生產方面的套用。
7.根據權利要求6所述的套用，其特徵在於，是將所述釀酒酵母接種於以澱粉質原料和纖維素原料經過糖化後的含有多糖組成的液體或固體基質中，發酵生產燃料乙醇，能夠利用各種多糖組分，提高原料利用率和產物產率。
實施方式
風味物質檢測：運用頂空固相微萃取技術（HS-SPME）和氣相色譜-質譜（GC-MS）方法對揮發性產物進行分析，取8毫升樣品，放入裝有3克NaCl的頂空進樣瓶中，加入10微升濃度為42.60毫克·升的4-甲基-2-戊醇為內標。將頂空瓶於50℃恆溫萃取45分鐘。萃取完後進行GC-MS分析。
實施例1 釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463碳源同化水平
採用Biolog碳源同化鑑定深孔板培養，挑取單菌落接種於YPD液體培養基，200轉每分，30℃條件下培養16-20小時後獲得種子液。將種子液用生理鹽水稀釋至OD600＝0.05後轉接至biologYT微孔鑑定版（購買於華粵行儀器公司），接種量100微升，28℃恆溫培養72小時，測定OD590和OD730。其中，OD590、OD730大於0.2且小於0.8時，表示該碳源可以被利用但利用程度不高；OD590、OD730大於0.8時，代表該碳源可以很好地利用。biolog做了2個平行，圖上有*標記的含義表示經one-wayANOVA分析P<0.05。
結果如圖2所示：相對於釀酒酵母模式株Saccharomyces cerevisiaeS288c僅僅可以利用葡萄糖、蔗糖等常見碳源，CCTCC NO:M 2014463還可以利用葡萄糖、半乳糖、木糖和阿洛酮糖，蔗糖、麥芽糖、蜜二糖、松二糖、海藻糖，棉子糖及其它寡糖。其中，對於半乳糖和麥芽糖的利用已做搖瓶實驗進行了驗證。
實施例2 釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463耐受脅迫條件能力
釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463與釀酒酵母模式菌株Saccharomyces cerevisiae S288C脅迫環境耐受能力的比較。
溫度耐受性：菌株活化後，按接種量2％，以YPD液體培養基分別於30℃、37℃、44℃靜置培養48小時後測定OD600。
乙醇耐受性：菌株活化後，按接種量2％，以YPD液體培養基為基礎培養基，分別添加0％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％（v/v）於30℃靜置培養48小時後測定OD600。
酸耐受性：菌株活化後，按接種量2％，以YPD液體培養基為基礎培養基，用乳酸調pH為5、4.5、4、3.5、3、2.5、2於30℃靜置培養48小時後測定OD600。
結果如圖3所示，由圖3可以看出：釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463能夠耐受能夠耐受高溫（44℃），耐酸（pH2.0），耐酒精（16％）。CCTCC NO:M 2014463的耐酸能力強於對照菌株，在pH2的條件下，對照菌株OD只能達到0.2，幾乎不生長，而該發明的酵母OD能達到0.8，是pH5條件下的66.67％。此外，CCTCC NO:M 2014463耐受乙醇的能力也強於對照菌株，其在16％酒精濃度下的最大生物量為對照菌株的2倍。
實施例3 釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463風味代謝能力
釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463能夠代謝多種風味物質。將其接種於高粱汁培養基，於30℃條件下配製發酵栓進行靜置培養，發酵5d時間，通過GC-MS檢測發酵液中的風味代謝產物。
結果如圖4所示，釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463能夠代謝：酸類（己酸、辛酸、壬酸、9-癸烯酸）、醇類（乙醇、異丁醇、異戊醇、丁醇、己醇、-2-壬烯-1-醇、3-甲基-1-己醇、1-辛醇、壬醇、3-甲基-1-己醇、苯乙醇、月桂醇、反式-橙花叔醇、法呢醇）、酯類（乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、4-己烯酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸-2-苯基乙酯、苯乙酸-2-苯基乙酯、異己基-2-苯乙酯、2，4-己二烯酸乙酯）和苯乙醛、苯乙酮4-乙烯基愈瘡木酚。
所述高粱汁培養基還可以被YNB培養基代替。
實施例4 添加釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463提高碳源利用率和乙醇產量
挑取單菌落接種於YPD液體培養基，200轉每分，30℃條件下培養16-20小時後獲得種子液。將種子液用生理鹽水稀釋至OD600＝1轉接至單一碳源或者混合碳源（總碳源含量為2％）培養基，200轉每分，30℃條件下搖瓶培養48小時，每隔6小時取樣一次，測定生物量及發酵液中乙醇產量和殘糖，結果如圖5至圖7所示。
從圖6可以看出：在含有1％葡萄糖和1％麥芽糖的混合碳源培養基條件下，釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463的生物量和產乙醇量都達到對照菌株S288c的2倍。而從耗糖曲線可以看出釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463可以同時利用葡萄糖和半乳糖。
同理，從圖7可以看出：在含有1％葡萄糖和1％半乳糖的混合碳源培養基條件下，釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463的生物量和產乙醇量都達到S288c的2倍。而從耗糖曲線可以看出釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463可以同時利用葡萄糖和麥芽糖。
以上結果表明，在只含葡萄糖的單碳源培養基中，釀酒酵母的碳源利用、生長及產乙醇同S288c比較差異不明顯；但是在含有麥芽糖和葡萄糖或者半乳糖和葡萄糖的混合碳源培養基中，該釀酒酵母菌株在其生長對數期初期已經有效利用麥芽糖以及半乳糖，其生長曲線沒有二次生長現象，釀酒酵母的最終產乙醇量達到Saccharomyces cerevisiaeS288c的2倍，這也說明在混合碳源培養基中CCTCC NO:M 2014463的碳源利用率高、產乙醇量也高。
實施例5 釀酒酵母CCTCC NO:M 2014463的多碳源利用能力
挑取CCTCC NO:M 2014463和S288c的單菌落接種於YPD液體培養基，200轉每分，30℃條件下培養16-20小時後獲得種子液。將種子液用生理鹽水稀釋至OD600＝1轉接至碳源為1％蔗糖、1％木糖、1％蜜二糖的培養基中，於200轉每分，30℃條件下搖瓶培養48小時，每隔6小時取樣一次，測定生物量及發酵液中乙醇產量和殘糖，結果發現CCTCC NO:M 2014463在生長對數初期就能有效利用這三種糖，最終乙醇產量達到Saccharomyces cerevisiaeS288c的2.6倍。
序列表
榮譽表彰
2018年12月20日，《一株能以多碳源共發酵的釀酒酵母及其套用》獲得第二十屆中國專利銀獎。
