《一株中度嗜鹽嗜鹼菌Na+/H+逆向轉運蛋白轉運機制研究》是依託山東大學，由楊春玉擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：一株中度嗜鹽嗜鹼菌Na+/H+逆向轉運蛋白轉運機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：楊春玉
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
前期我們從強鹼性造紙黑液分離到中度嗜鹽嗜鹼菌Halomonas sp. 19-A，優勢存在於造紙黑液中且對造紙黑液具有突出的處理能力。該細菌對鹽鹼的耐受能力與其本身的離子轉運性能直接相關。本項目擬通過轉運活性測定、蛋白轉錄及表達水平差異分析等方法，對該菌基因組預測的4個Na+/H+逆向轉運蛋白的轉運功能進行分析比較，闡述Na+/H+轉運蛋白在菌株應對極端環境中的作用；同時，對中度嗜鹽嗜鹼菌中缺乏相關研究的Mrp多亞基複合體進行進化及轉運機制研究。通過雙向Blue Native-PAGE、免疫印跡分析等檢測複合體存在形式和各亞基結合形式，確定各亞基的功能作用；通過生物信息學方法研究Mrp系統在不同微生物之間的進化關係並進行定點突變。該研究對於闡述19-A菌株在造紙黑液中的生存機制、深入揭示Na+/H+逆向轉運蛋白尤其是Mrp系統在中度嗜鹽嗜鹼微生物中的功能與作用機制具有重要的理論意義。
結題摘要
Halomonas sp. Y2(19-A)為一株分離自強鹼高鹽造紙黑液的耐鹽嗜鹼微生物。研究闡述其耐鹽鹼機制對於該菌株的套用具有重要意義。基於Na+(K+)/H+轉運蛋白對菌株耐鹽鹼性的重要作用，本項目針對該菌株的Na+(K+)/H+轉運蛋白進行系統研究。 首先，通過基因組測序和轉錄組分析，發現該蛋白具有發達的各類轉運系統及系列相溶性溶質合成途徑。其中無機離子的轉運系統在轉錄組中表現為明顯上調。對基因組注釋的4個Na+/H+逆向轉運蛋白序列進行轉錄水平分析及螢光定量PCR驗證。進一步通過異源表達功能驗證、反轉膜活性測定、基因敲除等技術，確定四個蛋白在該菌株耐受不同鹽鹼環境時存在分工協作機制。該研究成果已發表在“Journal of Biological Chemistry”上（2016，291:26056-26065） 在分工協作機制中Mrp蛋白在Halomonas sp. Y2耐受高鹽強鹼環境中發揮重要作用。該蛋白複合體由七個亞基組成，在功能上存在協同作用且每個亞基在執行轉運功能時必不可少。Mrp轉運蛋白具有明顯的Na+(Li+)轉運活性，同時在鹼性條件下表現出很強的K+外排功能，並且在Halomonas sp. Y2菌株耐受高鉀壓力中發揮關鍵作用。通過各類K+外排相關蛋白敲除、螢光定量PCR及原子吸收等技術，證明該菌株的K+外排作用具有明顯的Na+依賴性且Mrp在其中發揮關鍵作用。另外，基於不同Mrp同源蛋白的多序列比對，找出系列相對保守位點進行定點突變及突變體轉運功能活性測定，發現了一些與轉運活性及離子特異性相關的重要位點。研究成果投稿至Journal of bacteriology，正在修回。 另外，Halomonas sp. Y2基因組中存在兩個NhaD型同源蛋白且存在明顯的轉運活性差異。首先通過異源表達和定點突變闡述了兩個蛋白的轉運功能及關鍵位點。進一步研究發現N端截短後轉運功能完全喪失，說明在結構中具有不可缺失的作用；通過系列嵌合體構建、螢光能量共振遷移技術（FRET）證明NhaD型蛋白的C、N端在C、N端在蛋白結構上距離較近且在轉運活性上具有協同作用。相關研究成果發表在“Extremophiles” （2016, 20:631-639）、“Journal of Bacteriology”上，（2017, 199:1-11）上
