《β-內醯胺醯化酶底物在酶催化過程中的運動軌跡》是依託上海交通大學，由黃曦擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：β-內醯胺醯化酶底物在酶催化過程中的運動軌跡
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：黃曦
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
生物大分子的構象變化，特別是從基態到過渡態的變化，是酶催化反應所必需的一個重要組成部分。本項目擬通過研究β-內醯胺醯化酶分子中發生的三種完全不同類型的酶催化反應，包括，正常底物分子的水解、酶分子的親和標記和頭孢菌素醯化酶前體及中間體的自身剪下動力學，並結合已有的晶體學數據來描述底物/配體分子在醯化酶中的運動軌跡，從而揭示酶在催化反應中的動態過程。現有結果表明,頭孢菌素醯化酶的底物類似物BA-7ACA能夠特異性地標記在該酶分子中的TrpB4上，而TrpB4卻處於一個緊密堆積的三明治結構的中心。這意味著在酶催化過程中，酶分子必須有一個很大的構象變化，形成一個貫穿於整個酶分子的底物通道。這一動態分子模型的建立將為包括青黴素醯化酶（PA）和頭孢菌素醯化酶（CA）在內的Ntn超級家族的酶學研究和分子改造提供新的思路。
結題摘要
生物大分子的構象變化，是酶催化反應所必需的一個重要組成部分。頭孢菌素醯化酶（CA）和青黴素G醯化酶（PGA）可用於生產重要的製藥中間體，具有很高的套用價值。研究β-內醯胺醯化酶分子中發生的三種完全不同類型的酶催化反應之間的相互關係，包括，（1）底物的水解、（2）親和標記和（3）頭孢菌素醯化酶自身剪下中間體的進一步剪下，並結合晶體學數據則有可能揭示酶在催化反應中的動態過程。 溴乙醯-7ACA（BA-7ACA）能夠親和標記這類醯化酶，通過LC-MS檢測，發現其標記機理在於SerB1的羥基上發生了烷基化反應。這一發現糾正了以前文獻報導中的錯誤。有趣的是，對於PGA，BA-7ACA具有雙重特性，一方面它能被PGA水解，另一方面它能通過親和標記抑制酶的活性。這預示著底物/配體在酶催化中心的結合是一個動態過程。 長期以來，對於CA的第二步自剪下機制一直存在著很大爭議，主要原因在於對該酶的動態機制缺乏認識。首先，通過高分辨質譜我們確定了CA前體中的空間肽是由GDPPDLADQG組成的10肽，並證實了CA -亞基的C端是Glu169。它對於CA的第二步自剪下具有高度的專一性。將Glu169移動到空間肽的任何位置，第二步自剪下都發生在它的C端，這與酶的水解功能具有很高的相似性。這些結果闡明了CA的第二步自剪下是的分子內相互作用，由N-端親和基團催化完成。這一新催化模型的提出預示該酶必須經歷一個很大的構象變化，以克服距離約22埃的空間障礙。這一發現為酶催化的動態機制提供了重要的實驗證據。 研究還發現空間肽被縮短的CA突變株仍然可以發生自剪下。因此我們對三個具有代表意義的突變株進行了晶體學研究。與野生型結構比較，突變蛋白結構變化主要發生在-亞基C端。經計算發現，突變後的晶體結構存在較大的勢能變化，足以克服水解反應和第二步自剪下反應的活化能能壘，說明了酶的構象變化對催化反應有重要貢獻。 環噻唑黴素生物合成途徑的研究則是在課題調整過程中的另一亮點。環噻唑黴素屬於硫肽類抗生素，經由核糖體合成後再由一系列的酶參與後修飾，形成一系列的異常胺基酸衍生結構，最後成環切割分泌到胞外。我們成功克隆了環噻唑黴素合成基因簇，並實現了在變鉛青鏈黴菌中的異源表達。根據生物信息學分析我們推導了環噻唑黴素生物合成途徑。隨後利用點突變環噻唑黴素前體肽的方法，獲得了一系列環噻唑黴素衍生物。
