Western bloting技術是用來檢測蛋白表達的特定的靈敏的方法，由蛋白質的SDS-PAGE、電轉及雜交幾部分組成。
基本介紹
- 中文名：werstern bloting
- NC膜：硝酸纖維素膜
- 儀器：電轉移槽，電泳儀等
- 試劑：48Mm Tris,39mM甘氨酸等
簡介,材料方法,
簡介
Western bloting技術是用來檢測蛋白表達的特定的靈敏的方法，由蛋白質的SDS-PAGE、電轉及雜交幾部分組成。雜交技術主要有NC膜封閉，靶蛋白與第一抗體的反應，結合靶蛋白的一抗和二抗的反應，顯色等組成。將凝膠上的蛋白質轉移到NC膜上，用其他蛋白作為封閉液，將膜上餘下的其他蛋白結合位點封閉，加入與檢測蛋白特異性的第一抗體，經免疫反應，一抗與靶蛋白結合，經洗膜液洗滌後，膜上僅在靶蛋白上結合抗體。在加入與第一抗體有免疫特異性的二抗，使之與一抗反應，反應後，經洗膜液洗滌，二抗僅存在於結合靶蛋白的一抗上。因為這種二抗都為酶標抗體，通過酶標反應，在顯色液中，膜上結合靶蛋白—一抗—二抗的位置即將呈現一定的顏色。
材料方法
1.材料
從微生物細胞中提取的多酚氧化酶（PPO）：10μl，20μl
NC膜：硝酸纖維素膜
2.儀器：
電轉移槽，電泳儀，塑膠封口機，搖床
3.試劑：
轉移緩衝液：48Mm Tris,39mM甘氨酸，0.037%SDS同時加入20%乙醇。
封閉液與稀釋液：PBS（牛血清白蛋白）
辣根過氧化物酶顯色液：現配現用
三、操作步驟
1.SDS-PAGE電泳見上個實驗
2.電轉
⑴剪NC膜大小、濾紙與凝膠板一致，浸泡在轉移緩衝液中5min。
⑵在轉移裝置中依次將三層濾紙、凝膠、濾紙、三層濾紙放在一起。
⑶將裝好的轉移裝置放入電轉移槽中NC膜一側向正極，凝膠一面向負極。
⑷接通電源電壓63V，電流90mA,轉移過夜。
⑸轉移結束後，取出裝置，依次取掉各層，用鉛筆在膜的上沿做標記，切下其中一個孔所對應膜的一半。
⑹NC膜的封閉：將NC膜放入一塑膠袋中，加入封閉液3ml，封口，輕輕震盪2h。
⑺將封閉好的NC膜放入另一塑膠袋中，加入用封閉液稀釋的一抗，2.8ml，封口。4℃下輕搖2h。
⑻洗膜：棄去反應液，用一抗稀釋液洗三次，每次10min。
將膜從PBS中取出轉至150mM氯化鈉，50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中輕輕震盪10min。
⑼將二抗用二抗稀釋液稀釋，將NC膜放入塑膠袋中，加入二抗溶液2.8ml。封口，輕輕震盪1h。
⑽洗膜：取出膜轉至150mM氯化鈉，50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中輕輕震盪10min，三次。
⑾將膜放入顯色液中，室溫輕輕搖動，10min。
⑿待條帶出現後，立刻用水洗膜，然後轉入PBS中，觀察記錄。
