p53信號通路在泡狀棘球蚴發育調控中的功能和作用機制

《p53信號通路在泡狀棘球蚴發育調控中的功能和作用機制》是依託廈門大學，由程喆擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：p53信號通路在泡狀棘球蚴發育調控中的功能和作用機制
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：程喆
• 依託單位：廈門大學

項目摘要

泡狀棘球蚴病是一種嚴重危害人體健康、被我國列為重點防治的人獸共患病。.p53及其相關信號通路在調控細胞生命活動中發揮重要作用。本課題將克隆泡狀棘球蚴p53基因，利用生物信息學、酵母雙雜交及免疫沉澱技術對其基因結構和生物學功能進行鑑定和分析。表達重組蛋白，製備抗體，採用RT-PCR、原位雜交和免疫組化技術對其進行表達水平和定位分析。在體外培養體系基礎上，對p53在泡狀棘球蚴不同發育時段和不同培養條件下的表達活化情況進行研究，重點分析泡囊出芽增殖初期生髮層細胞中p53的表達活性。同時通過使用p53抑制劑阻斷相關信號途徑，體外模擬宿主免疫細胞造成的氧化損傷以及結合動物感染實驗，研究p53信號通路在細胞發育增殖、DNA損傷修復、細胞凋亡和抵禦宿主免疫殺傷過程中的作用機制。從分子生物學水平認識泡狀棘球蚴在寄生過程中的發育調控機制，為以p53及其相關蛋白為作用靶點的棘球蚴病藥物研發奠定理論基礎。

結題摘要

泡狀棘球蚴病是由多房棘球絛蟲(Echinococcus multicularia, E.m)幼蟲寄生所致的人畜共患寄生蟲病。該病被認為是最致命的蠕蟲感染病，是我國目前主要防治的寄生蟲病之一。p53是一種重要的轉錄調控因子，參與多種細胞生命活動的調控，包括細胞周期調控、細胞增殖與凋亡、DNA損傷修復等。本項目在我們前期工作基礎上，克隆出多房棘球絛蟲p53全長基因序列。結合基因預測、定位等生物信息學分析，結果顯示emp53基因全長約4.8kb，含9個內含子，僅存在一種轉錄剪下體形式，編碼序列CDS為2079bp。其編碼胺基酸序列中的p53-DNA結合結構域高度保守，三級結構預測表明其與哺乳動物p53蛋白三級結構相似。EMSA實驗表明Emp53蛋白可與公認的p53結合DNA序列結合，表明其可能參與了泡狀棘球蚴的基因轉錄調控。隨後我們將其N-端130個胺基酸進行了原核表達並製備了多克隆抗體（Emp53-Ab1）。Emp53-Ab1可以與體外原核/真核表達的全長Emp53蛋白特異結合，同時亦能用於WB實驗和IHC實驗檢測不同發育時期泡狀棘球蚴（原頭節、囊泡）中的Emp53。利用WB實驗和qRT-PCR我們發現，在H2O2刺激後，Emp53其轉錄水平和蛋白水平均顯著上調，表明Emp53參與了氧化脅迫的應激反應，提示其在對抗宿主免疫細胞攻擊產生的ROS應激反應中發揮作用。TUNEL實驗結果表明UV照射會引起泡狀棘球蚴的細胞凋亡。UV介導的細胞凋亡在加入p53抑制劑Pifithrin-α後，細胞凋亡數目顯著減少。說明Emp53參與調控了泡狀棘球蚴體內DNA損傷引起的細胞凋亡。通過體外轉染p53-/-細胞株H1299，我們發現Emp53可以部分恢復UV介導的細胞凋亡，表明Emp53具有類似哺乳動物p53調控DNA損傷引起的細胞凋亡的功能，而且這一調控機制和通路與哺乳動物相似。qRT-PCR實驗結果表明體外培養的原頭節和囊泡，囊泡生長迅速期和平緩期中的Emp53其轉錄水平並無顯著差異。本課題首次鑑定了寄生蠕蟲p53基因，填補了p53基因在這一動物類群中的進化地位和功能作用的研究空白。闡明了寄生過程中p53在泡狀棘球蚴發育增殖、細胞凋亡、DNA修復及抗氧化損傷的功能機制，為以p53及其相關蛋白為作用靶點的棘球蚴病藥物研發奠定了基礎。