microRNAs介導人結腸癌淋巴管生成的作用及機制研究

《microRNAs介導人結腸癌淋巴管生成的作用及機制研究》是依託上海交通大學，由童錦祿擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：microRNAs介導人結腸癌淋巴管生成的作用及機制研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：童錦祿
• 依託單位：上海交通大學

項目摘要

結腸癌已成為嚴重威脅我國人民健康的惡性腫瘤，其高侵襲轉移特性與腫瘤誘導淋巴管生成密切相關，探尋腫瘤淋巴管生成的分子調控機制是抗結腸癌侵襲轉移的重要課題。我們將從miRNA的層面揭示人結腸癌淋巴管生成的調控機制，通過比較未處理的淋巴管內皮細胞和腫瘤誘導過的淋巴管內皮細胞的miRNA表達譜，篩選出人結腸癌淋巴管生成相關的miRNA，確定人結腸癌淋巴管生成相關miRNA作用的靶基因，以進一步闡明人結腸癌淋巴管生成的分子機制。並在體外試驗中觀察人結腸癌淋巴管生成相關miRNA對淋巴管生成的影響，為體內試驗作鋪墊。該項目將是國內外首次從miRNA調控水平來闡明人結腸癌淋巴管生成的分子機制,為抗腫瘤淋巴管生成提供了嶄新的思路。

結題摘要

淋巴管生成相關miRNA的研究幾近空白。尋找人結腸癌淋巴管形成相關miRNA，探討miR-27a在人結腸癌淋巴管形成過程中的潛在功能，進一步預測並驗證miR-27a的靶基因及其功能。運用miRNA晶片檢測干預後的HLEC，篩選差異miRNA，利用qPCR法進行驗證。通過軟體預測miR-27a可能調控的靶基因。根據miR-27a結合候選靶基因的3’UTR位點，構建相應的報告基因載體及突變體轉染至HLEC中，檢測報告酶變化情況。將不同濃度過表達的靶基因載體及靶基因siRNA轉染入HLEC中，觀察其淋巴管形成情況並比較。miRNA晶片發現2倍以上表達上調的miRNA共21條，2倍以上表達下調的miRNA共26條。實時定量螢光PCR法驗證其中4條和miRNA晶片結果相一致。30.00nM和60.00nM的miR-27a mimic的HLEC管樣形成長度為對照組的5.13±0.79倍和8.18±1.32倍，HLEC的遷移細胞數分別為對照組的1.85±0.40倍和3.19±1.16倍。反之，30.00nM和60.00nM的miR-27a inhibitor的HLEC管樣形成長度為對照組的46.93±7.36% 和93.63±0.87%，HLEC遷移細胞數分別較對照組減少30.54±11.38% 和55.52±5.22%。miR-27a antagomir干預後的裸鼠移植瘤體積較對照組生長緩慢並且體積明顯縮小，干預組移植瘤的微淋巴管密度較對照組明顯降低。生物信息學分析結果顯示Smad4可能為miR-27a的靶基因。隨著miR-27a mimic濃度的增加SMAD4蛋白的表達減少，而隨著miR-27a inhibitor濃度的增加SMAD4蛋白的表達增加。螢光素酶報告基因實驗結果顯示，與突變組相比，上調miR-27a後，Smad4野生組的螢光素酶值隨著miR-27a濃度的不同分別下降了42.33±7.02%和56.67±7.77%。p3TP-Lux報告系統進一步證實miR-27a作用於TGF-β通路。隨著HLEC中Smad4的表達上調，淋巴管的形成顯著減少，而隨著Smad4的表達下調，淋巴管的形成顯著增加。miR-27a通過作用於Smad4促進人結腸癌淋巴管的形成，可能作為抑制結腸癌生長轉移的新的重要治療靶點。