《miRNA-501和let-7a促進HBV複製的機制研究》是依託中國人民解放軍第四軍醫大學，由時永全擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：miRNA-501和let-7a促進HBV複製的機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：時永全
- 依託單位：中國人民解放軍第四軍醫大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
B肝病毒（HBV）相關性疾病嚴重威脅國人的健康，現有治療方法尚無法完全清除體內的B肝病毒。microRNA(miRNA)是一類廣泛存在於生物體內的小RNA，在轉錄後水平調控基因的表達, 參與人體多種重要生理、病理過程。本課題組利用miRNA表達譜晶片發現 miR-501和let-7a在HBV穩定複製細胞系的表達上調，且在體外證實它們的抑制物可顯著抑制HBV複製。本項目擬通過1.組織標本進一步確定miR-501和let-7a表達水平與HBV複製狀態的關係；2.報告基因實驗和Western blot等技術驗證miR-501和let-7a對假定靶基因的調控作用，並探討可能的下游通路；3.構建慢病毒介導的miRNA抑制性表達載體,觀察miR-501和let-7a作為分子靶點用於抑制體內HBV複製的作用。本項目將從全新角度探討HBV複製的分子機制, 進而為抗HBV治療提供新思路和途徑。
結題摘要
我們前期通過miRNA晶片篩選和qRT-PCR驗證發現，miR-501和let-7a在HepG2.2.15中的表達水平顯著高於HepG2。本課題旨在探討miR-501和let-7a對HBV複製的影響及其機制。取得的研究結果有：1.將miRNA的特異性抑制劑轉染入HepG2.2.15中，qPCR和ELISA檢測顯示，miR-501和let-7a 的抑制劑能顯著降低HBV DNA、mRNA 和蛋白水平，並且具有時間依賴性；2. 生物信息學預測的眾多 miR-501 的靶基因中包括已明確的HBV複製抑制分子 HBXIP，而 let-7a 的預測靶基因中包括HBV mRNA 序列和已明確的HBV複製相關分子Ras；3. miR-501 特異性抑制劑顯著增高了HBXIP蛋白在HepG2.2.15細胞中的表達水平，但不影響其mRNA 水平；miR-501 通過結合克隆於螢光素酶基因編碼區下游的HBXIP 3’UTR 的靶位點，抑制螢光素酶表達；4. HBXIP siRNA 能有效抑制HBXIP 蛋白的表達，並能逆轉 miR-501抑制劑對HBV複製的抑制效果； 5. 根據計算機預測，let-7a 可能直接作用於HBV mRNA 序列，將let-7a 的潛在作用靶點克隆入報告基因載體，雙螢光素報告基因結果表明，let-7a 不能直接作用於HBV mRNA 序列；與對照細胞相比，轉染 let-7a反義抑制物的 HepG2 細胞的 K-Ras 蛋白水平明顯升高，而 mRNA 水平則無顯著差異；let-7a 通過結合克隆於螢光素酶基因編碼區下游的 K-Ras 3’UTR的靶位點，抑制螢光素酶表達；6. let-7a 的抑制劑有效抑制HBV核心啟動子和增強子的活性，發揮類似 Ras 通路的功能；負顯性突變的 Ras 能逆轉 let-7a的抑制劑對HBV複製的抑制作用；7. 新鮮臨床標本檢測表明，let-7a 和 miR-501 在HBV高複製肝組織中的表達水平明顯高於HBV低複製肝組織。上述結果提示，miR-501和let-7a分別通過負性調控HBXIP和Ras而促進HBV複製。
