miR858調控丹參迷迭香酸合成的機理研究

《miR858調控丹參迷迭香酸合成的機理研究》是依託陝西師範大學，由王健擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：miR858調控丹參迷迭香酸合成的機理研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：王健
• 依託單位：陝西師範大學

項目摘要

迷迭香酸由苯丙烷和酪氨酸代謝途徑產生,是丹酚酸B等酚酸類活性化合物的核心前體。我們發現，過表達擬南芥PAP1轉錄因子可顯著提高丹參中丹酚酸B的含量，而丹參中miR858對PAP1的表達具有潛在負調控作用。我們推測，丹參中可能存在【miR858表達→PAP1表達水平→關鍵酶基因表達→迷迭香酸合成】這樣一種調控模式，而且PAP1對miR858的表達可能也有調節作用。本課題擬通過分析miR858過表達和沉默丹參株系中PAP1表達的變化，明確miR858對PAP1的負調控；比較丹參中上調或沉默PAP1後miR858的表達變化，探究PAP1對miR858表達的調節作用；進而在丹參中同時過表達PAP1和沉默miR858，通過研究轉化株系內miR858調控PAP1的表達對迷迭香酸及其酚酸類成分合成的影響，揭示丹參中miR858調控迷迭香酸合成的分子機制，為通過對miRNA的調控進行分子育種奠定理論基礎。

結題摘要

丹參是我國傳統大宗道地藥材。迷迭香酸及其它酚酸類化合物是丹參中的主要活性成分，由苯丙烷類和酪氨酸代謝途徑產生。目前對丹參迷迭香酸生物合成途徑調控機制的研究主要側重於探討相關轉錄因子對關鍵酶基因表達的調控，而相關轉錄因子自身表達調控的研究報導較為少見。MicroRNA (miRNA) 是一類長度約為22 個核苷酸的內源單鏈非編碼RNA，通過負調控相關轉錄因子基因的表達來控制植物個體生長發育，是一種新的基因調控方式。因此，在miRNA水平研究參與丹參迷迭香酸生物合成途徑調控的轉錄因子基因的表達調控，闡述轉錄因子被相應miRNA介導的負調控作用機制，能夠為進一步通過基因工程提高丹參體內轉錄因子的表達水平奠定一定的理論基礎。前期研究結果顯示，SmPAP1作為一個轉錄因子正向調控迷迭香酸生物合成，但關於丹參體內SmPAP1的表達調控機制尚不清楚。因此，本課題為了探究SmPAP1在miRNA水平的調控，首先利用“modified 5’RACE”體外分析了丹參miR858對PAP1 mRNA的作用位點；然後利用artificial-microRNA載體構建原理和方法分別構建過表達miR858以及對MIR858進行特異性沉默的植物表達載體，利用上述所構建載體分別對丹參進行轉化，獲得了相應的轉基因丹參植株，體內明確miR858對SmPAP1的靶向負調控作用。為了進一步探究丹參體內是否存在SmPAP1對miR858表達豐度的反饋式調節作用，構建了“miR858作用位點”定點突變的35S-pro:PAP1mutBS(PAP1R)和特異性沉默SmPAP1的植物表達載體並分別對丹參進行轉化獲得相應的轉基因丹參植株，旨在分析在SmPAP1表達水平顯著升高、下調的狀況下丹參轉化植株內miR858表達豐度的變化。實驗結果顯示，丹參體內miR858對SmPAP1的確具有靶向負調控；丹參體內SmPAP1對MIR858表達似乎並不具有明顯的的反饋式調節作用；與對照植株相比，MIR858特異性沉默的轉基因丹參植株中迷迭香酸和丹酚酸B的含量分別提高了2.9和2.1倍。因此，該項目研究結果暗示，通過基因工程特異性沉默MIR858的表達，解除丹參miR858對SmPAP1表達的抑制作用，可以提高丹參體內SmPAP1的表達水平，實現在miRNA水平調控丹參迷迭香酸的生物合成。