《miR-29調控PD-1甲基化介導HBV免疫逃逸的分子機制研究》是依託四川大學，由陳捷擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：miR-29調控PD-1甲基化介導HBV免疫逃逸的分子機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：陳捷
- 依託單位：四川大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
課題組前期研究中發現負性分子PD-1的高表達與HBV持續感染有關，但導致PD-1增高的分子機制不明。國內外研究新近證實PD-1的低甲基化是造成其高表達的原因，結合課題組前期發現miR-29在慢性HBV感染者中表達增高的現象，以及目前miR-29在感染免疫中發揮負性調節作用的最新研究熱點，推測miR-29通過抑制其靶基因DNMT誘導PD-1的低甲基化和高表達，介導病毒免疫逃逸。課題組以慢性HBV感染者及病毒自發清除者為研究對象，分析其miR-29、PD-1表達及PD-1甲基化情況，並用miR-29模擬物轉染細胞及shRNA技術進行體外試驗證實推論。項目預期將揭示，miR-29通過抑制甲基化轉移酶DNMT，造成負性分子PD-1低甲基化，從而引起負性信號異常活化，誘導宿主免疫耐受和病毒免疫逃逸。項目的研究成果對於研究表觀修飾在B肝病毒免疫逃逸中的作用機制和探索新的治療方案具有重要意義。
結題摘要
HBV相關肝臟疾病嚴重危及人類健康，本課題組長期關注T細胞免疫調節機制在HBV感染免疫中的作用，前期發現免疫共抑制分子PD-1在HBV感染者外周血中的高表達誘導宿主的細胞免疫平衡向耐受的方向偏移，可能是造成病毒在體內持續複製和病程遷延進展的主要原因。在前期研究基礎上，本課題篩查了慢性HBV感染者與自發清除者的差異miRNA，發現15種miRNA在慢性B肝組顯著高於自發清除組，22種miRNA在慢性B肝組顯著低於自發清除組；採用TargetScan、miRanda、KEGG資料庫和GCBI分析軟體預測差異miRNA的靶基因，通過GO分析和pathway分析發現了與差異miRNA調控的靶基因最相關的10個信號通路。根據上述生物信息學分析挑選出與HBV感染慢性化有關的差異miRNA，採用RT-PCR法定量檢測差異miRNA在兩組中的表達情況，發現在慢性HBV感染者中miR-29、miR-34、miR-4485表達顯著增高, miR-330-3p、miR-125、miR-1468、miR-3180表達顯著降低，提示它們可能是潛在的HBV感染慢性化的分子靶標。通過生物信息學預測軟體分析發現DNMT3A的3’UTR區含有miR-29的預測結合位點，同時採用雙螢光素酶報告基因檢測技術證明miR-29在螢光素酶載體中可以抑制DNMT 3’UTR區的表達。採用亞硫酸氫鹽修飾DNA甲基化特異PCR(即MSP法) 分析PD-1的甲基化情況，發現PD-1的甲基化率在慢性B肝組顯著低於自發清除組，並與PD-1的表達水平及miR-29表達水平負相關。 採用Jurkat細胞和HepG2.2.15細胞共培養的體外試驗反映淋巴細胞免疫調節與病毒入侵的肝細胞之間的相互作用效應。分別給予miR-29的過表達和抑制，檢測淋巴細胞中CD8+T細胞（CTL細胞）和PD-1的表達水平、PD-1甲基化率及病毒複製情況。明確慢性HBV感染者PD-1的低甲基化是引起PD-1高表達並造成效應T細胞功能耗竭和病毒免疫逃逸的原因之一；闡明miR-29抑制甲基化轉移酶DNMT，是引起負性分子PD-1低甲基化和高表達的原因，證實表觀遺傳修飾參與介導了HBV病毒免疫逃逸的分子機制，相關結果已發表在SCI收錄的期刊，為進一步探尋HBV感染慢性化診治新靶點奠定基礎。
