delta113p53特異性拮抗p53介導的細胞凋亡分子機理研究

《delta113p53特異性拮抗p53介導的細胞凋亡分子機理研究》是依託浙江大學，由陳軍擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：delta113p53特異性拮抗p53介導的細胞凋亡分子機理研究
• 依託單位：浙江大學
• 項目負責人：陳軍
• 項目類別：面上項目

項目摘要

腫瘤抑制基因p53通過監測細胞受損程度來控制細胞的生與死，確保機體的遺傳穩定性。最近我們在斑馬魚中發現p53存在著異構體?113p53。進一步研究揭示?113p53 是p53目標基因，通過改變p53下游基因的表達，特別是特異性提高抗凋亡基因Bcl2L的表達，來阻止細胞凋亡，但其作用的分子機理還不清楚。?133p53(人)在很多癌症細胞中過量表達，不知是否是腫瘤基因。本項研究目標如下：.1、通過免疫共沉澱方法，鑑定?113p53和p53是否能形成異源多聚體。證明此異源多聚體是不是?113p53行使功能所必需的。.2、採用染色質免疫共沉澱法來證實此異源多聚體是否直接影響p53對其目標基因的驅動性。.3、構建轉基因斑馬魚過量表達?113p53，觀察是否生長腫瘤，證明?113p53是否是腫瘤基因。.研究結果將會進一步揭示?113p53的功能及其調節p53的分子機制，並對癌症治療有重要的指導作用。

結題摘要

根據項目執行中，起得的進展和面臨的問題，我們對實驗計畫作了適當的調整。從以下三個方面來完成本項目：1、△113p53與p53形成複合體是否是△113p53拮抗細胞凋亡的所必需的；2、△113p53調控轉錄分子機制。申請書列出的目標基因p21，bcl2L在斑馬魚基因組中的測序未完成，難以克隆啟動子。同期我們發現p53抑制，△113p53促進DNA雙鏈斷裂修復基因rad51的表達，所以調整到通過對rad51啟動子研究來揭示△113p53的轉錄功能；3、由於用CMV-△113p53未能得到轉基因魚，我們構建了可誘導表達△113p53轉基因魚和特異性敲除△113p53突變體，研究其對發育和腫瘤發生的影響。 內容1：構建只識別全長p53抗體和識別p53和△113p53的抗體，證明p53和△113p53在體內形成複合體。通過對△113p53的多聚體結構域進行定點突變，構建了6個突變體，其中兩個突變體不能與p53結合，發現只有這兩個突變體不能拮抗p53介導的細胞凋亡，從而證明，△113p53與p53形成雜合複合體是△113p53特異性拮抗p53介導的細胞凋亡的所必需的，該成果正在投稿中。 內容2：構建rad51的啟動子啟動egfp表達載體，發現它能夠真實反應體內rad51的表達，軟體分析找到rad51啟動子中含有兩個新的類型p53結合域，研究表明一個是p53抑制rad51表達所必需的，另一個是△113p53促進rad51表達所必需的。ChIP和EMSA 表明，P53優先結合到第一位點，△113p53隻結合到第二位點。從而發現了p53和△113p53調控基因表達的新機制。部分成果已發表在Journal of Genetics and Genomics (2012, 39:489-502)，餘下成果正在投稿當中。 內容3：用CMV-△113p53過表達載體來構建轉基因斑馬魚，但從1000多條f0代中，未能篩選到轉基因斑馬魚。這可能是由於過表達△113p53有致死作用。於是我們改變策略，用四環素誘導的表達載體來構建△113p53轉基因斑馬魚，現已獲得兩個轉基因系；並且還通過TALEN的方法，對△113p53的啟動子的關鍵區域進行突變，獲得專一性的敲除△113p53斑馬魚。進一步的實驗正在進行當中。 本項目已發表SCI論文一篇，另兩篇正在投稿，結論：完成任務。