《Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑》是公安部物證鑑定中心於2014年3月11日申請的專利，該專利的公布號為CN103866019A，授權公布日為2014年6月18日，發明人是歐元、趙興春、葉健、姜伯瑋。
《Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑》公開了Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑。該發明提供了DNA檢驗引物組，包括用於擴增如下21個Y-STR位點的引物對組。該發明的實驗證明，該發明提供的DNA檢測試劑，能夠同時檢驗21個Y-STR位點，且引物特異性高，可以得到完整的STR分型，並且峰型尖銳清晰，平衡性好，無Pull-up峰、stutter帶，無非特異性人工產物出現，完全能夠滿足法醫Y-STR檢驗的要求。
2020年7月14日，《Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑》獲得第二十一屆中國專利獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名：Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑
- 申請人：公安部物證鑑定中心
- 申請日：2014年3月11日
- 申請號：2014100877422
- 公布號：CN103866019A
- 公布日：2014年6月18日
- 發明人：歐元、趙興春、葉健、姜伯瑋
- 地址：北京市西城區木樨地南里17號
- Int. Cl.：C12Q1/68(2006.01)I、C12N15/11(2006.01)I
- 代理機構：北京紀凱智慧財產權代理有限公司
- 代理人：關暢
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
DNA檢驗技術尤其是（Short Tandem Repeats）STR檢測技術自20世紀80年代中期問世以來，在刑事、民事案件、大型災難性事故（如：美國9·11恐怖攻擊、印尼海嘯、汶川大地震）及群體性突發事件中均發揮了巨大的作用。短串聯重複序列（STR），又稱微衛星DNA（microsatellite DNA），STR檢測技術主要是通過對這些特異性STR位點的多態性進行檢測，在獲得了多個相應STR位點的信息後，進行多位點信息的平行比對，從而實現了個體識別和親權鑑定。STR檢測以其特有的技術優勢，幾十年來一直是法醫遺傳學研究的熱點和核心，並被廣泛套用於法醫學個體識別和親子鑑定等多個領域。歐盟法醫DNA分型標準委員會認為，雖然新技術與新遺傳標記不斷湧現，但在2014年前乃至之後相當長的時期內，STR將仍然是最主要的人特異性遺傳標記。
人類Y染色體在遺傳過程中不與另外的染色體發生重組，且序列結構特徵能穩定地由父親傳給兒子並為男性所特有，具有父系遺傳特點。大多數暴力案件和所有的強姦案件中都有男性參與。因此，Y-STR在法庭科學中的作用逐漸顯現。在沒有父親的父權鑑定時，利用Y染色體STR基因座（Y-STR）的父系遺傳特點，可以通過父系親屬進行鑑定。在混合斑鑑定中，特別是無法用兩步法分離的情況下，Y-STR更具優勢。在輪姦案件中，Y-STR對於確定案犯人數也有很大作用。此外，由於Y-STR具有父系遺傳的特點，不同種族、不同地區的群體，Y-STR的分布存在著差異性，對其分型可以揭示嫌疑人的種族、居住地甚至是姓氏。
截至2014年3月，隨著分子生物學技術的飛速發展，越來越多的Y-STR被開發和利用。1997年，Prinz等第一次建立了Y-STR複合擴增體系，命名為Quadruplex I，分別用兩種螢光JOE和FAM標記DYS19、DYS389I、DYS389II和DYS390，並做了法醫學套用性研究。美國ABI（Applied Biosystems）公司推出了Y-Filer試劑盒，包含DYS456、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS458、DYS19、DYS385、DYS393、DYS391、DYS439、DYS635、DYS392、YGATA-H4、DYS437、DYS438、DYS448等17個Y-STR位點。美國Promega公司也研發出包含DYS391、DYS389I、DYS439、DYS389II、DYS438、DYS437、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b等12個Y-STR位點的PowerPlex Y試劑盒。這些Y-STR檢驗試劑盒在法醫DNA檢驗領域發揮著越來越大的作用。
隨著微量Y染色體STR檢驗技術的發展，其套用範圍有進一步擴大的趨勢，如Y-DNA資料庫建設和大規模樣本的快速排查。
發明內容
專利目的
《Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑》的一個目的是提供一種DNA檢驗引物組。
《Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑》的另一個目的是提供一種DNA檢驗試劑。
《Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑》的第三個目的是提供一種DNA檢驗試劑盒。
技術方案
《Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑》提供的DNA檢驗引物組，包括用於擴增如下21個Y-STR位點的引物對組；所述用於擴增如下21個Y-STR位點的引物對組為如下：
用於擴增Y-STR位點DYS460的引物對，其由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2組成；
用於擴增Y-STR位點DYS458的引物對，其由序列表中序列3所示的引物3和序列表中序列4所示的引物4組成；
用於擴增Y-STR位點DYS389I或Y-STR位點DYS389II的引物對，其由序列表中序列5所示的引物5和序列表中序列6所示的引物6組成；
用於擴增Y-STR位點DYS438的引物對，其由序列表中序列7所示的引物7和序列表中序列8所示的引物8組成；
用於擴增Y-STR位點DYS390的引物對，其由序列表中序列9所示的引物9和序列表中序列10所示的引物10組成；
用於擴增Y-STR位點DYS392的引物對，其由序列表中序列11所示的引物11和序列表中序列12所示的引物12組成；
用於擴增Y-STR位點DYS393的引物對，其由序列表中序列13所示的引物13和序列表中序列14所示的引物14組成；
用於擴增Y-STR位點DYS437的引物對，其由序列表中序列15所示的引物15和序列表中序列16所示的引物16組成；
用於擴增Y-STR位點DYS385a或用於擴增Y-STR位點DYS385b的引物對，其由序列表中序列17所示的引物17和序列表中序列18所示的引物18組成；
用於擴增Y-STR位點YGATA_H4的引物對，其由序列表中序列19所示的引物19和序列表中序列20所示的引物20組成；
用於擴增Y-STR位點DYS391的引物對，其由序列表中序列21所示的引物21和序列表中序列22所示的引物22組成；
用於擴增Y-STR位點DYS447的引物對，其由序列表中序列23所示的引物23和序列表中序列24所示的引物24組成；
用於擴增Y-STR位點DYS19的引物對，其由序列表中序列25所示的引物25和序列表中序列26所示的引物26組成；
用於擴增Y-STR位點DYS448的引物對，其由序列表中序列27所示的引物27和序列表中序列28所示的引物28組成；
用於擴增Y-STR位點DYS456的引物對，其由序列表中序列29所示的引物29和序列表中序列30所示的引物30組成；
用於擴增Y-STR位點DYS635的引物對，其由序列表中序列31所示的引物31和序列表中序列32所示的引物32組成；
用於擴增Y-STR位點DYS439的引物對，其由序列表中序列33所示的引物33和序列表中序列34所示的引物34組成；
用於擴增Y-STR位點DYS527a或用於擴增Y-STR位點DYS527b的引物對，其由序列表中序列35所示的引物35和序列表中序列36所示的引物36組成。
上述的引物組中，所述引物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36的摩爾比為0.12:0.12:0.2:0.2：0.65:0.65:0.45:0.45：0.25:0.25:0.6:0.6:0.15:0.15:0.2:0.2:0.35:0.35:0.4:0.4:0.25:0.25:0.45:0.45:0.2:0.2:0.25:0.25:0.4:0.4:0.45：0.45：0.60:0.60:0.80:0.80。
所述各個引物對中的各條引物均獨立包裝。
上述引物的摩爾比為使用時的摩爾比。
上述的引物組中，各個所述引物對中的一條引物均用螢光標記。
上述的引物組中，所述用於擴增Y-STR位點DYS460的引物1的5’末端、用於擴增Y-STR位點DYS458的引物3的5’末端、用於擴增Y-STR位點DYS389I或Y-STR位點DYS389II的引物5的5’末端、用於擴增DYS438的引物7的5’末端、用於擴增DYS390的引物9的5’末端和用於擴增DYS392的引物11的5’末端均用FAM標記；
所述用於擴增DYS393的引物13的5’末端、所述用於擴增DYS437的引物15的5’末端、所述用於擴增Y-STR位點DYS385a或用於擴增Y-STR位點DYS385b的引物17的5’末端、所述用於擴增YGATA_H4的引物19的5’末端均用HEX標記。
所述用於擴增Amelogenin的引物37的5’末端、所述用於擴增DYS391的引物21的5’末端、所述用於擴增DYS447的引物23的5’末端、所述用於擴增DYS19的引物25的5’末端、所述用於擴增DYS448的引物27的5’末端均用TAMRA標記；所述用於擴增DYS456的引物29的5’末端、所述用於擴增DYS635的引物31的5’末端、所述用於擴增DYS439的引物33的5’末端、所述用於擴增Y-STR位點DYS527a或用於擴增Y-STR位點DYS527b的引物35的5’末端。
上述的引物組中，所述引物組的各條引物為獨立包裝。
《Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑》提供的DNA檢測試劑，由上述的引物組、dNTP、MgCl2、BSA、DNA聚合酶和水組成。
上述DNA檢測試劑中，所述用於擴增DYS460的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.12微米；
用於擴增DYS458的的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.20微米；
用於擴增DYS389I或DYS389II的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.65微米；
用於擴增DYS438的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.45微米；
用於擴增DYS390的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.25微米；
用於擴增DYS392的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.60微米；
用於擴增DYS393的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.15微米；
用於擴增DYS437的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.2微米；
用於擴增DYS385a/b的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.35微米；
用於擴增YGATA_H4的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.4微米；
用於擴增DYS391的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.25微米
用於擴增DYS447的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.45微米；
用於擴增DYS19的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.2微米；
用於擴增DYS448的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.25微米；
用於擴增DYS456的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.4微米；
用於擴增DYS635的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.45微米；
用於擴增DYS439的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.6微米；
用於擴增DYS527a/b的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.8微米。
《Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑》提供的DNA檢驗試劑盒，包括上述的引物組或上述試劑。
上述的引物組或上述試劑在製備用於檢測樣本或樣本排查的產品中的套用也是該發明保護的範圍。上述套用中，所述樣本為離體血液或者血液採集卡。
改善效果
《Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑》的實驗證明，該發明針對21個Y-STR位點設計36條引物，由這些引物、PCR緩衝液和DNA酶組成DNA檢測試劑，能夠同時檢驗21個Y-STR位點，且引物特異性高，可以得到完整的STR分型，並且峰型尖銳清晰，平衡性好，無Pull-up峰、stutter帶，無非特異性人工產物出現，完全能夠滿足法醫DNA大規模樣本檢驗的要求。因此，可以將其用於大規模樣本Y-STR檢驗過程中，高多態性的常染色體的STR位點能夠起到標記同一家系樣本的作用，能夠實現樣本的迅速排查和區分。提高排查效率，節約檢驗成本，節省檢驗時間。
附圖說明
圖1為Y-STR檢測試劑的STR位點排布圖
圖2為Y-STR檢驗試劑進行血卡樣本的直接擴增檢測
技術領域
《Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑》涉及生物技術領域，尤其涉及一種用於人類Y染色體DNA檢驗的試劑及專用引物，具體涉及Y-STR螢光複合擴增檢驗試。
權利要求
1.DNA檢驗引物組，包括用於擴增如下21個Y-STR位點的引物對組；
所述用於擴增如下21個Y-STR位點的引物對組為如下：
用於擴增Y-STR位點DYS460的引物對，其由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2組成；
用於擴增Y-STR位點DYS458的引物對，其由序列表中序列3所示的引物3和序列表中序列4所示的引物4組成；
用於擴增Y-STR位點DYS389I或Y-STR位點DYS389II的引物對，其由序列表中序列5所示的引物5和序列表中序列6所示的引物6組成；
用於擴增Y-STR位點DYS438的引物對，其由序列表中序列7所示的引物7和序列表中序列8所示的引物8組成；
用於擴增Y-STR位點DYS390的引物對，其由序列表中序列9所示的引物9和序列表中序列10所示的引物10組成；
用於擴增Y-STR位點DYS392的引物對，其由序列表中序列11所示的引物11和序列表中序列12所示的引物12組成；
用於擴增Y-STR位點DYS393的引物對，其由序列表中序列13所示的引物13和序列表中序列14所示的引物14組成；
用於擴增Y-STR位點DYS437的引物對，其由序列表中序列15所示的引物15和序列表中序列16所示的引物16組成；
用於擴增Y-STR位點DYS385a或用於擴增Y-STR位點DYS385b的引物對，其由序列表中序列17所示的引物17和序列表中序列18所示的引物18組成；
用於擴增Y-STR位點YGATA_H4的引物對，其由序列表中序列19所示的引物19和序列表中序列20所示的引物20組成；
用於擴增Y-STR位點DYS391的引物對，其由序列表中序列21所示的引物21和序列表中序列22所示的引物22組成；
用於擴增Y-STR位點DYS447的引物對，其由序列表中序列23所示的引物23和序列表中序列24所示的引物24組成；
用於擴增Y-STR位點DYS19的引物對，其由序列表中序列25所示的引物25和序列表中序列26所示的引物26組成；
用於擴增Y-STR位點DYS448的引物對，其由序列表中序列27所示的引物27和序列表中序列28所示的引物28組成；
用於擴增Y-STR位點DYS456的引物對，其由序列表中序列29所示的引物29和序列表中序列30所示的引物30組成；
用於擴增Y-STR位點DYS635的引物對，其由序列表中序列31所示的引物31和序列表中序列32所示的引物32組成；
用於擴增Y-STR位點DYS439的引物對，其由序列表中序列33所示的引物33和序列表中序列34所示的引物34組成；
用於擴增Y-STR位點DYS527a或用於擴增Y-STR位點DYS527b的引物對，其由序列表中序列35所示的引物35和序列表中序列36所示的引物36組成。
2.根據權利要求1所述的引物組，其特徵在於：所述引物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36的摩爾比為0.12:0.12:0.2:0.2：0.65:0.65:0.45:0.45：0.25:0.25:0.6:0.6:0.15:0.15:0.2:0.2:0.35:0.35:0.4:0.4:0.25:0.25:0.45:0.45:0.2:0.2:0.25:0.25:0.4:0.4:0.45：0.45：0.60:0.60:0.80:0.80。
3.根據權利要求2所述的引物組，其特徵在於：各個所述引物對中的一條引物均用螢光標記。
4.根據權利要求2或3所述的引物組，其特徵在於：所述用於擴增Y-STR位點DYS460的引物1的5’末端、用於擴增Y-STR位點DYS458的引物3的5’末端、用於擴增Y-STR位點DYS389I或Y-STR位點DYS389II的引物5的5’末端、用於擴增DYS438的引物7的5’末端、用於擴增DYS390的引物9的5’末端和用於擴增DYS392的引物11的5’末端均用FAM標記；所述用於擴增DYS393的引物13的5’末端、所述用於擴增DYS437的引物15的5’末端、所述用於擴增Y-STR位點DYS385a或用於擴增Y-STR位點DYS385b的引物17的5’末端、所述用於擴增YGATA_H4的引物19的5’末端均用HEX標記。
所述用於擴增Amelogenin的引物37的5’末端、所述用於擴增DYS391的引物21的5’末端、所述用於擴增DYS447的引物23的5’末端、所述用於擴增DYS19的引物25的5’末端、所述用於擴增DYS448的引物27的5’末端均用TAMRA標記；所述用於擴增DYS456的引物29的5’末端、所述用於擴增DYS635的引物31的5’末端、所述用於擴增DYS439的引物33的5’末端、所述用於擴增Y-STR位點DYS527a或用於擴增Y-STR位點DYS527b的引物35的5’末端。
5.根據權利要求1-4中任一所述的引物組，其特徵在於：所述引物組的各條引物為獨立包裝。
6.DNA檢驗試劑，由權利要求1-5中任一所述的引物組、dNTP、MgCl2、BSA、DNA聚合酶和水組成。
7.根據權利要求6所述的DNA檢驗試劑，其特徵在於：
所述用於擴增DYS460的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.12微米；
用於擴增DYS458的的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.20微米；
用於擴增DYS389I或DYS389II的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.65微米；
用於擴增DYS438的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.45微米；
用於擴增DYS390的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.25微米；
用於擴增DYS392的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.60微米；
用於擴增DYS393的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.15微米；
用於擴增DYS437的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.2微米；
用於擴增Y-STR位點DYS385a或用於擴增Y-STR位點DYS385b的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.35微米；
用於擴增YGATA_H4的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.4微米；
用於擴增DYS391的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.25微米
用於擴增DYS447的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.45微米；
用於擴增DYS19的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.2微米；
用於擴增DYS448的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.25微米；
用於擴增DYS456的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.4微米；
用於擴增DYS635的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.45微米；
用於擴增DYS439的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.6微米；
用於擴增Y-STR位點DYS527a或用於擴增Y-STR位點DYS527b的引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度均為0.8微米。
8.DNA檢驗試劑盒，包括權利要求1-5中任一所述的引物組或權利要求6或7所述試劑。
9.權利要求1-5中任一所述的引物組或權利要求6或7所述試劑在製備用於檢測樣本或樣本排查的產品中的套用。
10.根據權利要求9所述的套用，其特徵在於：所述樣本為離體血液或者血液採集卡。
實施方式
實施例1、Y-STR複合擴增檢驗試劑的製備
1、Y-STR複合擴增系統位點的排布
由於Y-STR具有父系遺傳的特點，因此，確定用於大規模樣本排查的DNA檢驗的位點如下21：21個Y-STR位點。上述21個Y-STR位點分別為DYS460、DYS458、DYS389I、DYS438、DYS389II、DYS390、DYS392、DYS393、DYS437、DYS385a/b、YGATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635、DYS439、DYS527a/b；其STR位點的排布方式如下圖1所示。
2、Y-STR複合擴增系統專用擴增引物
根據上述位點設計複合擴增引物，引物序列及濃度如表1所示。
表1為複合擴增引物序列
表1為複合擴增引物序列
擴增引物分別用FAM，HEX，TAMRA，ROX四種螢光素標記。
其中DYS460、DYS458、DYS389I、DYS438、DYS389II、DYS390、DYS392的擴增引物用FAM標記。
其中DYS393、DYS437、DYS385a/b、YGATA_H4的擴增引物用HEX標記。
其中DYS391、DYS447、DYS19、DYS448的擴增引物用TAMRA標記。
其中DYS456、DYS635、DYS439、DYS527a/b的擴增引物用ROX標記。
FAM，HEX，TAMRA，ROX四種螢光素分別標記在正向擴增引物的5’端。
3、Y-STR螢光複合擴增檢驗系統的製備
用於大規模樣本排查的DNA檢驗試劑即為PCR擴增體系，具體如下，下面的終濃度為在擴增體系中的終濃度：2×PrimerMix為將表1所示的36條引物按照表1所示使用的濃度進行混勻。
每10微升的PCR擴增體系如下：2微升5×PCR緩衝液（各物質的在DNA檢驗試劑中的終濃度如表2所示）、5微升2×PrimerMix（各條引物在DNA檢驗試劑中的終濃度如表1所示）、0.2微升5U/μL的FastSTAR DNA聚合酶（Roche公司，貨號：12032902001），其餘用水補足體積。
表2為5×PCR緩衝液的組分
PCR擴增體系即為用於Y染色體DNA STR位點的檢驗試劑。因此，DNA檢驗試劑由具有表1所示終濃度的引物、終濃度為200微米 dNTP、終濃度為1.6毫摩爾每升的MgCl2、終濃度為400微克/毫升的BSA、終濃度為1U/μL DNA聚合酶和水組成。
實施例2、Y-STR複合擴增檢驗試劑的套用
1、樣本製備
樣本為公安部物證鑑定中心日常DNA資料庫建設所積累。樣本均為紙質類型，為血液採集卡。將血液採集卡（已知為男性）用0.5毫米手持式打孔器打下一片圓片（不超過1.2毫米），置於0.2毫升薄壁管中。
2、樣本擴增
將10微升由實施例1製備的DNA檢驗試劑加入上述裝有血液採集卡的薄壁管中，進行PCR擴增。PCR擴增程式為：95℃，11分鐘；94℃，30秒，59℃，2分鐘，72℃，1分鐘，28個循環；60℃，1小時，25℃，forever。
3、PCR產物檢測
取上述擴增產物1微升加入10微升 Hi-Di甲醯胺（ABI公司），置於ABI3130xl遺傳分析儀內進行毛細管電泳檢測，具體操作步驟參照產品說明書。採用GeneMapper ID v3.2軟體進行數據分析，其檢測結果如下圖2所示，上述樣本（男性）得到了完整的STR分型，並且峰型尖銳清晰，平衡性好，無Pull-up峰、stutter帶，無非特異性人工產物出現。完全能夠滿足法醫DNA大規模樣本檢驗的要求。
因此，可以用《Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑》的DNA檢測試劑可以用於大規模樣本Y-STR檢驗過程中，高多態性的常染色體的STR位點能夠起到標記和區分同一家系不同個體樣本的作用，能夠實現樣本的迅速排查和區分。提高排查效率，節約檢驗成本，節省檢驗時間。
榮譽表彰
2020年7月14日，《Y-STR螢光複合擴增檢驗試劑》獲得第二十一屆中國專利獎優秀獎。
