Wnt5a在牙乳頭分化中的作用及與BMP2的串話

《Wnt5a在牙乳頭分化中的作用及與BMP2的串話》是依託四川大學，由葉玲擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：Wnt5a在牙乳頭分化中的作用及與BMP2的串話
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：葉玲
• 依託單位：四川大學

項目摘要

Wnt5a信號轉導途徑與多種器官的發生密切相關，且參與了多胚層器官發育過程中的上皮間充質相互作用。wnt5a在牙胚發育過程中恆定表達在牙胚間充質中，但其作用機制尚不清楚。我們構建了Wnt5a基因表達病毒載體轉染牙乳頭細胞，發現Wnt5a信號傳導抑制牙乳頭細胞的增殖和遷移，促進其分化，提示該信號傳導途徑與牙乳頭的發育有關。本項目在我們已有工作基礎上，進一步深入研究Wnt5a在牙乳頭分化中的作用。通過建立牙胚間充質Wnt5a條件基因敲除動物模型，觀察阻斷Wnt5a信號傳導對牙乳頭髮育的影響；採用基因晶片、螢光酶報告基因、Western Blot等方法，研究Wnt5a在牙乳頭細胞內的信號轉導途徑；以JNK和PTEN/AKT通路為切入點，研究Wnt5a與BMP2在牙乳頭細胞中的串話機制。本項目的實施有助於揭示Wnt5a信號傳導途徑與牙乳頭髮育的關係，對闡明牙齒髮育的分子機制有重要的意義。

結題摘要

本研究通過構建Wnt5a過表達重組腺病毒，製備Wnt5a條件培養基（Wnt5aCM），套用Western blot和免疫螢光，研究了Wnt5a是否激活Wnt/β-catenin等信號通路，套用RT-PCR檢測與牙胚發育密切相關的核轉錄因子的表達。通過免疫螢光、細胞粘附實驗、細胞劃痕及Transwell實驗研究Wnt5a對牙乳頭細胞（human dental papilla cells, HDPCs）粘附、伸展以及遷移能力的影響。 套用重組蛋白Bmp2和Wnt5a條件培養基刺激HDPCs，通過ALP和茜素紅染色檢測過表達Wnt5a或（和）Bmp2對HDPCs分化能力的影響，套用RT-PCR和Western blot分析相關基因的表達和信號通路的改變。結果發現：Wnt5a在HDPCs中不促進β-catenin核轉位及經典通路的活化。Wnt5a上調DLX1，DLX2，LEF1，MSX2，PAX9，RUNX2 mRNA的表達，下調BARX1、PITX2 mRNA水平，且Wnt5a作用HDPCs後， p42/44 MAPK、P38 MAPK、JNK、AKT通路均活化。Wnt5a可促進HDPCs的早期粘附，促進中期伸展，抑制後期遷移能力。Wnt5a可激活RhoA、JNK通路，提示二者參與Wnt5a對HDPCs粘附、伸展、遷移能力的調節過程。且Wnt5a能部分增強其粘附能力而抑制其伸展、遷移能力。CCK-8和流式細胞術顯示Wnt5a基因沉默後，對HDPCs增殖能力無顯著作用；Wnt5a基因沉默後，ColI，OC，OPN，DMP1和BSP表達無改變；細胞劃痕及Transwell實驗顯示Wnt5a基因沉默細胞的遷移能力與對照組無差別。體內實驗結果顯示Wnt5a基因沉默不影響HDPCs形成牙本質基質的量。Wnt5a和Bmp2可協同促進HDPCs的分化，smad4和P38通路被活化。Bmp2通過smad4調控P38的磷酸化，P38的活性又影響Wnt5a的表達和smad1/5的磷酸化；而Wnt5a對Bmp2的促進作用不受smad4和P38的調控。結論：Wnt5a通過Wnt非經典通路促進HDPCs的分化。Wnt5a可促進HDPCs的粘附，伸展但抑制其遷移能力。Wnt5a和Bmp2協同促進HDPCs的分化，smad4和P38在二者串話中發揮重要作用。