《TRx/TBP2在晶狀體上皮細胞自噬中的作用及調控機制》是依託浙江大學，由俞一波擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：TRx/TBP2在晶狀體上皮細胞自噬中的作用及調控機制
- 依託單位：浙江大學
- 項目負責人：俞一波
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
本課題組曾首次報導硫氧還蛋白（TRx）對晶狀體上皮細胞（LECs）具有抗氧化的保護作用；TRx結合蛋白2（TBP2）負性調節TRx活性並介導高水平氧化應激誘導的細胞凋亡；而低濃度的氧化刺激未能誘導細胞活性明顯降低，但自噬水平顯著上升，且受TBP2的調節。為深入研究，本項目擬通過建立低濃度氧化刺激誘導的LECs自噬模型，利用Western Blot、過表達質粒載體、干擾RNA、細胞質線粒體分離等技術首次探討TRx/TBP2在LECs自噬中的調節作用及機制；同時採用RP-HPLC-MS/MS質譜分析及鑑定，尋找受TRx調控並引發自噬的特異性PSSP，為細胞自噬的啟動提供解釋。本項目預期闡明TRx/TBP2調控LECs自噬的機理，揭示低水平氧化刺激下LECs進行自我防禦和保護的分子機制，確定具有自噬誘導特異性的PSSP。有望為白內障的靶向防治研究提供理論依據，抑制和延緩年齡相關性白內障的發病。
結題摘要
本課題組曾首次報導硫氧還蛋白（Trx）對晶狀體上皮細胞（LECs）具有抗氧化的保護作用；Trx 結合蛋白2（TBP-2）負性調節Trx 活性並介導高水平氧化應激誘導的細胞凋亡；而低濃度的氧化刺激未能誘導細胞活性明顯降低，但自噬水平顯著上升，且受TBP-2的調節。 為深入研究，本項目以人晶狀體上皮細胞為研究模型，分析Trx/TBP-2在調節人晶狀體上皮細胞（HLEC-B3）回響外界氧化損傷導致自噬中的作用，並進一步分析Trx/TBP-2 調控自噬相關的發生機制。本課題組套用western blot、qRT-PCR、免疫螢光、透射電鏡、CCK-8、RP-HPLC-MS/MS 質譜分析等技術和方法深入研究發現： (1)通過不同濃度的H2O2處理人晶狀體上皮細胞24 小時，發現隨著濃度增加，細胞活性的喪失增加，選用居中的處理濃度，進行時間梯度的處理後，發現隨著時間的增加，細胞活性隨之下降，並通過Western blot、GFP-LC3 點聚集實驗、透射電鏡等驗證了在50μM的H2O2處理細胞12h時，細胞會發生自噬。(2)在該自噬條件下，TBP-2、Trx-2表達量明顯升高，而Trx-1表達無變化。在該過程中，Trx-1與TBP-2共定位更明顯，Trx-2與TBP-2共定位減少。間接說明TBP-2主要與Trx-1結合減低Trx-1的活性來調節自噬，而非Trx-2。(3)通過建立過表達TBP-2穩轉細胞株以及設計針對TBP-2 的特異性siRNA瞬時敲減TBP-2，發現TBP-2 能夠促進人晶狀體上皮細胞在氧化應激下發生自噬，活性喪失更多； (4)探索TBP-2涉及的機制發現TBP-2 對人類晶狀體上皮細胞在氧化應激下自噬調控主要發生在自噬的啟動階段，通過抑制Akt 的磷酸化來影響HLEC-B3 在氧化應激下的自噬，並且是通過非mTOR 途徑起效應的。(5)通過建立過表達Trx-1穩轉細胞株的建立，發現過表達Trx-1能夠增加細胞自噬，但是該自噬對細胞具有保護作用。 本項目闡明Trx/TBP-2在晶狀體上皮細胞回響外界氧化損傷、抗氧化和調節細胞自噬功能的作用及其分子機制，有助於深入探究晶狀體氧化損傷的防禦機制和白內障的發病機制，為白內障防治的研究提供新思路。
