《TALEN在小鼠體內對神經細胞基因組原位編輯的研究》是依託西南大學，由徐興然擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：TALEN在小鼠體內對神經細胞基因組原位編輯的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：徐興然
- 依託單位：西南大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
基因組缺陷與多種腦內疾病有關，改造缺陷基因可從根本上阻斷疾病進程。目前尚無有效的方法實現腦基因組原位編輯。以多肽為載體，引導轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALEN)靶腦轉運是解決這個難題的有效途徑。本項目使用靶腦功能的RDP多肽，以Huntington's綜合徵致病關鍵基因it-15為對象，從三個方面闡明TALEN進入神經細胞定點修改靶基因：(1)構建在神經細胞發揮作用的TALEN質粒並製備RDP-TALEN蛋白，通過細胞和小鼠體內實驗驗證RDP-TALEN進入腦細胞對基因組編輯並影響Huntington's綜合徵進程；(2)RDP與包含特異啟動子的TALEN質粒形成多肽/核酸複合物，驗證TALEN僅在腦多巴胺神經元表達並起作用；(3)探討多肽攜帶TALEN蛋白及核酸的穿膜機制。本研究可為體內人工編輯腦細胞基因組提供安全有效的方法、並為探索神經元基因與動物疾病之間的關係，提供重要的理論依據。
結題摘要
亨廷頓舞蹈症(Huntington’s Disease，HD)是一種家族常染色體顯性遺傳病。近年來，對HD的研究報導逐漸增多並取得了一些進展，但對疾病發生的關鍵機制仍缺乏可靠的證據。目前對該病研究多選取以幹細胞為載體的HD細胞模型、分析其mHtt表達後細胞的生理生化指標；同時也有以腫瘤細胞為載體的HD原位敲入模型，但此種HD細胞模型僅有DNA原位測序鑑定結果，沒有基因組轉錄的mRNA及其翻譯mHtt的研究證據。因此，⑴本課題藉助TALEN和CRISPR/Cas9基因編輯技術，在HTT基因原位敲入加長CAG後、在以CATH-A細胞為載體的HD細胞模型和以C57BL為載體的HD小鼠模型中探索mRNA轉錄及mHtt翻譯在HD發病中的可能機制。⑵在研究中發現HTT基因轉錄RNA時在Exon1內部存在控制CAG（PolyQ）轉錄長度的可變剪接現象，並建立了檢測此現象的簡便檢測方法；藉助此種檢測方法我們完成人源神經細胞（U87MG, U251, H4, U-118MG, SW1088）鼠源細胞（Neuro-2A，CATH-A）及C57BL小鼠各個年齡段的各組織（大腦，小腦，肝臟，腎臟，肺，心臟，脾臟）大量檢測工作，實驗數據表明：所有受檢細胞和組織的HTT基因轉錄RNA的Exon1內均存在有效剪接現象。⑶在構建完成的HD（150Q 90Q 50Q 20Q四種CAG PolyQ敲入長度）細胞後，常規培養條件下沒有檢測到HTT基因原位敲入長度PolyQ 的轉錄、只有正常細胞(7Q)的轉錄，但在iPSC誘導培養條件下我們得到了完整 (50Q 20Q)長度PolyQ轉錄體；隨後在小鼠HD(150Q)模型中也有檢測到72Q 90Q 的轉錄體；以上實驗結果表明：HTT的Exon1內剪接控制著PolyQ的轉錄長度，即：可能決定著HD疾病的發生與否。我們現有的研究結果表明：HD發生的內在因素是基因組中CAG重複序列的增多，但第一外顯子內部剪接機制能夠在轉錄過程中修復突變的基因組序列，使成熟的mRNA保持PolyQ轉錄長度為7Q，目前其剪接機制尚不明確，但我們仍繼續推進此項研究。
