SmPAP1-SmMYC複合體調控丹參酚酸類活性成分合成的機理研究

《SmPAP1-SmMYC複合體調控丹參酚酸類活性成分合成的機理研究》是依託陝西師範大學，由王喆之擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：SmPAP1-SmMYC複合體調控丹參酚酸類活性成分合成的機理研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：王喆之
• 依託單位：陝西師範大學

項目摘要

酚酸類化合物是丹參重要的活性成分。我們發現轉錄因子SmPAP1及SmMYC與酚酸類成分的合成密切相關，SmPAP1對SmMYC的表達具有潛在的調控作用。推測丹參中存在SmPAP1-SmMYC複合體調控酶基因的表達進而控制酚酸類物質的合成，同時也調控SmMYC自身的表達，但其分子機制尚不清楚。本課題擬通過沉默SmMYC驗證其在丹參酚酸類化合物合成中的關鍵作用；利用酵母雙雜交和雙分子螢光補償法明確SmPAP1與SmMYC的相互作用；採用DNA酶I足跡、凝膠遷移率技術以及啟動子瞬時激活體系研究SmPAP1對SmMYC啟動子的特異結合及轉錄激活方式，並明確SmPAP1-SmMYC複合體作用於丹參酚酸類化合物合成途徑的酶基因；進一步在丹參中進行SmPAP1及SmMYC的過表達或共表達。研究結果有望闡明SmPAP1-SmMYC調控丹參酚酸類活性成分合成的分子機制，為丹參高效、可行的改良提供思路及策略。

結題摘要

丹參酚酸類化合物是丹參中的主要活性成分，由苯丙烷類和酪氨酸代謝途徑產生。目前對丹參酚酸類化合物合成途徑的調控機制研究較少。我們前期研究結果顯示丹參酚酸類化合物合成途徑上的酶基因與SmPAP1及SmMYC在表達水平上均呈現顯著性正相關，但是SmPAP1與SmMYC如何調控這些酶基因的表達及其具體作用方式仍不清楚。基於以上目標，本課題主要開展了以下研究工作：1.通過對SmMYC進行了特異性基因沉默，分析了SmMYC基因沉默株相應組織中酚酸類化合物代謝途徑上酶基因表達水平以及酚酸類化合物含量的變化，驗證SmMYC與丹參酚酸類化合物合成的相關性；2.依次通過進行酵母雙雜交以及菸草細胞內雙分子螢光補償法檢測實驗，檢測細胞內SmMYC與SmPAP之間是否存在蛋白相互作用；3.為了進一步探究丹參體內SmPAP1對SmMYC的轉錄調控作用，課題組首先利用凝膠電泳遷移率檢測（EMSA），分析了體外SmPAP1與SmMYC啟動子特異位點的結合情況，同時進一步採用啟動子瞬時激活檢測分析了SmPAP1過表達後SmMYC基因啟動子的轉錄激活情況；4.還我們檢測了調控蛋白與酶基因啟動子序列的位點特異性結合性，以確認SmPAP1-SmMYC轉錄複合體對酶基因的表達調控模式。實驗結果顯示，丹參體內SmMYC的確作為一個重要的轉錄因子參與了丹參酚酸類次生代謝產物合成的調控；在丹參體內確實存在著SmMYC與SmPAP1的蛋白相互作用，二者通過形成了一個轉錄複合體存在；凝膠電泳遷移率檢測（in vitro）以及啟動子瞬時激活檢測(in vivo)研究結果顯示，SmPAP1不但對SmMYC的啟動子具有激活作用，而且與SmMYC啟動子的相應順式作用DNA元件能進行特異性結合，說明在丹參體內SmPAP1的確作為SmMYC啟動子特定區域進行特異性結合。此外，我們還研究了丹參JAZ蛋白對酚酸類化合物合成的調控作用，並利用組合基因改造的方法獲得了高酚酸含量的丹參品系。同時課題組通過遺傳操作獲得了高抗性及高丹參酮含量丹參。為丹參次生代謝物質合成調控提供新的策略，且為丹參分子育種提供研究基礎。