《SMYD4：一個新的先天性心臟病候選基因的識別與驗證》是依託復旦大學，由黃國英擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：SMYD4：一個新的先天性心臟病候選基因的識別與驗證
- 依託單位：復旦大學
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：黃國英
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
先天性心臟病（簡稱先心病）是嚴重影響患者生命和生活質量的出生缺陷，研究其發病機制有重要意義。我們前期的全外顯子組測序結果提示，SMYD4可能是新的先心病候選基因，但需進一步證實。擬開展以下研究：①檢測SMYD4基因表達、DNA序列及其表達調控，揭示先心病患者中是否存在SMYD4基因缺陷；②採用CRISPR/Cas9技術敲除模式生物斑馬魚smyd4基因，明確smyd4基因缺陷對斑馬魚心臟表型的影響；③在細胞水平研究SMYD4基因對心肌細胞功能的影響，分析SMYD4基因相互作用蛋白，明確SMYD4在心臟發育過程中所參與的信號通路/調節網路以及SMYD4參與先心病發生的機制。通過上述系列研究，在先心病人群、模式生物斑馬魚和模式細胞等多種水平，從表型到基因型、再從基因型到表型，並進行機制研究，逐層深入地闡明SMYD4基因在先心病發生中的作用及其機制。該研究思路可為其他出生缺陷的病因學研究提供參考。
結題摘要
SMYD家族是一類組蛋白甲基轉移酶，SMYD1、SMYD2和SMYD3在骨骼肌發育和心肌發育過程中都發揮重要的作用，然而SMYD4在脊椎動物發育過程中的功能還所知甚少。我們通過二代測序發現部分先心病患者存在SMYD4基因變異，擬進一步通過模式生物整體觀察，結合心肌細胞分子相互作用，部分闡明SMYD4及其突變對心臟發育的影響及其分子機制。在208例先心病患者中鑑定到了3個稀有變異，分別為（c.C837T，p. H279H, c. 1034G＞A，p. G345D 和c. 1736G＞A， p.R579Q），其中，G345D預測致病性突變，該突變導致了蛋白結構的顯著變化。原位雜交顯示smyd4在斑馬魚心血管系統中能夠特異性顯著表達，提示smyd4在斑馬魚心臟發育過程中發揮重要作用。CRISPR/Cas9的方法構建了smyd4L544Efs*1突變體斑馬魚，純合突變體斑馬魚胚胎出現早期胚胎致死、發育遲滯以及嚴重的心臟畸形，提示smyd4對斑馬魚的胚胎髮育和心臟發育至關重要。通過體外細胞學研究，發現SMYD4能夠和一系列表觀調控因子結合，如HDAC1、LSD1和TCF25等，提示SMYD4在表觀調控和基因轉錄調控等方面發揮重要的作用。細胞免疫共沉澱證實G345D的變異破壞了SMYD4與HDAC1以及LSD1之間的結合；斑馬魚回補實驗結果顯示G345D變異會導致斑馬魚心臟發育異常。斑馬魚心臟組織和心肌細胞HL-1的RNA-sequencing數據顯示SMYD4功能缺失後，組織和細胞內基因表達譜發生顯著的改變，提示SMYD4的功能與表觀調控相關。在組織和細胞轉錄組的改變中，代謝通路以及Wnt信號等與心臟發育密切相關的信號通路發生了顯著變化。在細胞層面上，通過ChIP-sequencing的方法我們鑑定到了SMYD4結合的靶基因。通過結合RNA-sequencing和ChIP-sequencing數據分析發現，在心臟發育中，Wnt信號通路可能是SMYD4一個重要的調控環節。本項目研究結果首次揭示了SMYD4在斑馬魚的胚胎髮育以及心臟形成過程中至關重要，一方面SMYD4自身具有調控組蛋白修飾的功能，另一方面能夠影響HDAC1、LSD1和TCF25等轉錄調控密切相關蛋白的功能，從而影響心臟發育。遺傳學證據和功能學證據有力的證實了SMYD4的致病性變異是先心病的高危因素。
