SIRT1 對氧化應激誘導的EPCs功能障礙的調節和機制研究

《SIRT1 對氧化應激誘導的EPCs功能障礙的調節和機制研究》是依託上海交通大學，由陳書艷擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：SIRT1 對氧化應激誘導的EPCs功能障礙的調節和機制研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：陳書艷
• 依託單位：上海交通大學

項目摘要

去乙醯化酶SIRT1對細胞功能具有重要調節作用。我們前期結果顯示，氧化應激誘導的內皮祖細胞（EPCs）功能障礙與FoxO3a胞核轉位有關。新近有研究發現，胞核中FoxO又受到SIRT1和HCF1的調節。但迄今對氧化應激條件下，SIRT1與EPCs功能的關係仍知之甚少，其調節的機制有待進一步探討。為此我們提出假說：氧化應激通過下調 SIRT1表達和活性影響HCF1乙醯化水平，引起FoxO3a靶基因表達變化，導致EPCs功能障礙。為驗證這一假說，我們將通過人EPCs，大鼠氧化應激模型和小鼠動脈粥樣硬化模型，採用RT-PCR，Western blot，免疫共沉澱、腺病毒載體轉染、RNA干擾等手段，從分子、細胞、動物整體水平等多方面探討氧化應激條件下SIRT1表達和活性變化對EPCs功能的調節作用，明確SIRT1調節EPCs功能的機制。本研究結果為今後改善EPCs功能修復受損內皮提供新思路。

結題摘要

本研究基於內皮祖細胞的細胞治療在各種缺血性和血管損傷性疾病的治療中的套用前景。氧化應激會明顯降低內皮祖細胞的功能和數量。SIRT1通過對包括FOXOs在內的底物的去乙醯化作用，在多種病理生理過程中發揮重要的調控作用。在氧化應激條件下，SIRT1對內皮祖細胞功能的調控作用卻並不清楚。我們前期研究發現，FOXO3a是內皮祖細胞中的主要表達亞型，它能通過轉錄調控其靶基因Bim的表達而引起內皮祖細胞功能障礙。FOXOs的功能受轉錄後修飾的調控，如乙醯化，但是SIRT1對FOXO3a去乙醯化後，FOXO3a蛋白的變化卻不清楚。本研究通過密度梯度離心法從人臍血中分離培養出EPCs，通過形態學、細胞表面標誌物、攝取Dil-Ac-LDL和結合FITC-UEA-1的能力以及體外血管形成能力對其進行鑑定。H2O2(過氧化氫)處理內皮祖細胞誘導氧化應激，CCK-8檢測細胞存活情況，基質膠觀察體外血管生成能力，DNA片段檢測細胞凋亡，免疫螢光檢測SIRT1的細胞定位， Western Blot檢測SIRT1、FOXO3a、Bim、Bax和cleaved caspase-3的蛋白表達水平，qPCR檢測SIRT1和FOXO3a的mRNA表達水平,腺病毒介導的轉染用來過表達或沉默SIRT1，免疫共沉澱檢測SIRT1和FOXO3a的相互作用、FOXO3a的乙醯化水平和FOXO3a的泛素化水平。內皮祖細胞能攝取Dil-Ac-LDL和結合FITC-UEA-1，高表達CD34、CD133和VEGFR-2，具有體外血管形成能力。SIRT1位於細胞核中，且H2O2並不改變其細胞定位。H2O2處理24小時能明顯上調SIRT1蛋白水平。H2O2能劑量依賴的降低細胞存活率、降低體外血管形成能力和增加細胞凋亡。SIRT1過表達緩解H2O2誘導的內皮祖細胞功能障礙，SIRT1沉默和EX527（SIRT1特異性抑制劑）表現出相反作用。SIRT1過表達降低細胞內FOXO3a蛋白總量，而SIRT1沉默和EX527增加FOXO3a蛋白總量。SIRT1降低FOXO3a的轉錄活性。SIRT1能夠直接結合FOXO3a,降低其乙醯化水平和增加其泛素化水平。本研究的意義在於 SIRT1對氧化應激誘導的內皮祖細胞功能障礙起保護作用，機制可能是通過對FOXO3a的泛素化和隨後的降解來抑制FOXO3a蛋白表達和轉錄活性來實現的。