一個新型的多重PCR實驗。當運行RelayPCR反應時，會先進行目標序列捕獲，然後自動接力到文庫擴增，直至完成整個反應。
基本介紹
- 中文名：接力PCR
- 外文名：RelayPCR
什麼是RelayPCR（接力PCR）
RelayPCR由2個階段反應階段組成（見右圖1）。
圖1
Phase1 Target Capture
在RelayPCR體系中，預先加入反應所需的所有引物：特異性引物（specific primer）和通用引物（common primer）。Specific primer使用OmegaPrimer。
- 特異性的omega primer引物對與模板序列（template DNA）結合，進行2個Cycle的特異性擴增；請仔細查看上圖中序列的顏色變化。
- 2個Cycle擴增完畢後，omega primer的3p臂，5p臂，和環（loop）序列都已融入擴增子中，並完成了目標序列的捕獲。
需要說明的是，loop的序列不是任意設計的，它與Phase 2 Library Amplification中使用的通用引物序列相同（見圖中右下角）。2個Cycle結束時，通用引物的互補序列已納入擴增子序列的兩端。
Phase 2 Library Amplification
目標序列捕獲階段完成後，即自動進入文庫擴增階段。
- 體系中的通用引物（common primer），與擴增產物上的互補序列結合，進行文庫擴增。根據實驗需要，可在通用引物的尾部（tail segment）設計指定的序列，如測序引物，barcode等。
- 當所有的擴增循環結束後，目標序列的文庫即製備完成。如為靶向測序文庫，經純化後，即可上機測序，無需進行額外的接頭連線和擴增反應。
可這樣理解RelayPCR：運行一次RelayPCR反應即可同時完成目標序列捕獲與文庫擴增。
關於RelayPCR的常見問答
Q：OmegaPrimer是如何設計和工作的？
A：請在中文百科中查找OmegaPrimer介紹。
Q：在Phase1中，common primers不會干擾目標序列捕獲嗎？
A：不會。因為模板序列上沒有common primers的互補序列。
Q：commonprimer和omega primer不會相互雜交嗎？
A：不會。因為commonprimer與omega primer上的環序列是同向的，而非反向互補。
Q：為什麼目標序列捕獲完成後會自動接力到文庫擴增過程？
A：因為體系中commonprimer的量遠大於omega primer，因而在2個Cycle擴增完成後，擴增產物更易被common primer結合進行文庫擴增。
相比於傳統多重PCR，RelayPCR的優勢體現在：
傳統多重PCR，通常需要進行繁瑣的條件最佳化，但結果仍難以令人滿意。RelayPCR徹底克服了傳統多重PCR的制約。
RelayPCR是一個一步式PCR反應，可以將一對通用引物，成千上萬對特異性引物，和基因組DNA混合在一個樣品管中。運行一次PCR即可無縫連線並完成兩個功能獨立的反應階段，即靶標捕獲和文庫擴增。
RelayPCR技術創新在於，可以控制特異性引物（OmegaPrimer）只在最初靶標捕獲的兩個循環中發揮作用，之後會自動切換到由通用引物引導的以相同效率進行的文庫擴增，獲得均一性非常高的文庫（已有的實驗數據表明，均一性超過97%）。這樣的設計根本性地消除了傳統多重PCR中由於成千上萬對特異性引物的差異擴增給文庫製備造成的負面影響。
