ROP18在新孢子蟲和弓形蟲致病性差異中的功能分析

《ROP18在新孢子蟲和弓形蟲致病性差異中的功能分析》是依託中國農業大學，由劉晶擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：ROP18在新孢子蟲和弓形蟲致病性差異中的功能分析
• 依託單位：中國農業大學
• 項目負責人：劉晶
• 項目類別：青年科學基金項目

項目摘要

弓形蟲棒狀體蛋白18（TgROP18）通過磷酸化宿主細胞的免疫相關GTPase逃避宿主免疫殺傷機制，是弓形蟲的重要毒力因子，毒力最強的Ⅰ型蟲株ROP18的表達量最高。新孢子蟲與弓形蟲的形態結構及生物學特性相似，但毒力差異較大，ROP18可能是導致二者毒力差異的重要分子基礎。本項目擬藉助TgROP18的生物學信息對新孢子蟲棒狀體蛋白18(NcROP18)進行克隆、表達、定位和功能研究，通過敲除新孢子蟲內源性ROP18及轉入TgROP18比較分析NcROP18與TgROP18生物學功能，研究轉基因新孢子蟲表型和毒力的改變。探討ROP18是否為新孢子蟲與弓形蟲毒力差異的重要因子，為新孢子蟲和弓形蟲致病性差異的分子機制提供依據。

結題摘要

弓形蟲（T. gondii）和新孢子蟲（N. caninum）都是專性細胞內寄生原蟲，二者在形態學特徵和生物學特性上有許多相似之處，但是它們對小鼠的急性毒力卻存在顯著差異。本研究通過生物信息學分析發現新孢子蟲棒狀體蛋白18（NcROP18）的基因序列中插入了多個終止密碼子，不能表達相應的功能蛋白，是假基因。因此推測弓形蟲與新孢子蟲ROP18的差異可能是導致它們急性毒力差異的重要因素。將弓形蟲RH株的TgROP18定向克隆至pDMG表達載體，構建pDMG-TgROP18過表達質粒並轉染新孢子蟲，獲得表達TgROP18的轉基因新孢子蟲Nc-TgROP18單克隆蟲株。通過細胞培養觀察、噬斑實驗、運動實驗、滑移實驗、細胞入侵實驗及細胞內增殖實驗，對轉基因新孢子蟲和新孢子蟲Nc1株及弓形蟲RH的表型進行比較研究。結果顯示轉基因新孢子蟲在細胞內的增殖能力較新孢子蟲Nc1株增強，但在蟲體運動、滑行、微線蛋白分泌水平及入侵宿主細胞的能力沒有太大差異。小鼠毒力實驗表明，轉基因新孢子蟲與Nc1相比對小鼠的毒力增強，說明轉基因表達的TgROP18可以顯著增強新孢子蟲的毒力。為了進一步研究轉基因新孢子蟲毒力增強的分子機制，進行了IRGs募集實驗和磷酸化檢測，結果表明轉基因新孢子蟲通過TgROP18的磷酸化作用阻止IRGs向其納蟲空泡膜募集，以抵抗宿主細胞的免疫殺傷作用，從而導致其對宿主的毒力增強。本研究首次對弓形蟲與新孢子蟲毒力差異的分子機制進行了探索研究，確定了ROP18是弓形蟲與新孢子蟲毒力差異的重要因子。