《RNAi調控Ctr1和OCT2表達拮抗順鉑耳毒性及靶向治療價值》是依託復旦大學，由亓衛東擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：RNAi調控Ctr1和OCT2表達拮抗順鉑耳毒性及靶向治療價值
- 依託單位：復旦大學
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：亓衛東
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
課題組成員前期研究及文獻資料顯示：鉑通過特定的通道蛋白Ctr1、OCT2等實現跨膜轉運，這些蛋白在哺乳動物耳蝸組織廣泛存在，非特異性阻斷內流通道蛋白Ctr1 和OCT2可減弱順鉑耳毒性效應。Ctr1和OCT2由SLC31A1、SLC22A2基因編碼，套用特定技術暫時關閉編碼基因可阻斷順鉑的跨膜轉運進而預防耳毒性效應的啟動，這種禦敵於國門之外的策略應該比既往採取的抗氧化或抗凋亡保護更具實際套用價值。為明確Ctr1和OCT2在順鉑跨膜轉運中的作用及拮抗機制，課題組在擬在前期研究基礎上，以活體動物順鉑耳毒性模型為工具，套用RNAi手段特異性阻斷Ctr1和OCT2表達，從分子、細胞、聽功能多水平驗證Ctr1和OCT2作為治療靶點的價值，以小分子靶向藥物阻斷順鉑跨膜轉運為著眼點探索內耳保護的新方法，為RNAi 策略預防順鉑內耳損害提供證據支持。
結題摘要
本研究首先通過大鼠BRL細胞株和耳蝸器官型培養驗證了重組蛋白TAT-PTDR在體外的安全性、轉染效率和沉默效率。結果表明：TAT-DRBD可有效攜帶siRNA進入內、外毛細胞，轉染效率達100%且無耳毒性。TAT-DRBD在大鼠BRL細胞和耳蝸基底膜介導的靶向Slc31a1(CTR1)的RNAi可分別穩定下調目標基因表達63%和47%，雖然沉默效率較脂質體轉染（90%）略低，但鑒於蛋白載體可降解無毒性的特點，生物安全性高，有潛在的科研及臨床套用價值。在順鉑離體耳蝸損害模型，通過TAT-DRBD介導RNAi沉默Slc31a1基因以抑制Ctr1對順鉑的攝取，觀察到對順鉑耳毒性有明顯拮抗效應，耳蝸基底膜中段單位長度（100μm）毛細胞密度統計學上存在顯著性差異（87% vs 50%,P＜0.05）。此外，實驗中尚發現單一高濃度TAT-DRBD在體外對順鉑耳蝸損害有強烈的保護效應：在耳蝸器官型培養順鉑耳損害模型中，當TAT-DRBD濃度達到800nM時，對10μM順鉑模型的毛細胞保護可達到100%，對50μM順鉑耳蝸損害模型的毛細胞保護超過90%，當順鉑濃度達到100nM時，TAT-DRBD干預組仍明顯優於對照組（P＜0.01）。獲得了南美栗鼠全耳蝸基底膜長度、單位百分比長度（10%）毛細胞密度及變化趨勢，以及短聲和不同短純音誘發的CAP閾值。證實了南美栗鼠卡鉑耳蝸損傷的毛細胞損害程度及CAP閾移及振幅變化有良好的對應關係。驗證了經圓窗膜轉染，TAT-DRBD介導的靶向沉默Slc31a1基因對成年南美栗鼠卡鉑耳蝸損害的保護效應。結果表明：以50mg/kg腹腔注射卡鉑14天后，4kHz、8kHz短純音誘發的CAP未發生明顯閾移。全耳蝸基底膜鋪片顯示在耳蝸底回對內毛細胞損害有明顯保護（P＜0.01）。從干預細胞凋亡通路的角度，通過離體大鼠耳蝸器官培養體系，證實TAT-DRBD轉染靶向TP53的siRNA進入毛細胞介導RNAi能夠有效拮抗順鉑耳蝸損害，順鉑濃度為10μM時，100nM及200nM TP53-siRNA保護幾乎都達到100%（P＜0.01）。為提高內耳病理數據的分析效率，方便本課題及後續研究對實驗中獲得的耳蝸形態學數據進行更全面分析，開發了“全耳蝸毛細胞定量分析系統”軟體。
