RNA干擾盾纖蟲營養期與休眠期細胞分化關鍵基因的表達

《RNA干擾盾纖蟲營養期與休眠期細胞分化關鍵基因的表達》是依託福建師範大學，由曾紅擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：RNA干擾盾纖蟲營養期與休眠期細胞分化關鍵基因的表達
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：曾紅
• 依託單位：福建師範大學

項目摘要

盾纖類纖毛蟲是一類在海水養殖中造成重大危害的原生動物，目前尚無有效且安全的防治方法。形成休眠包囊是其抵禦極端環境、傳播及後期有效感染宿主的重要方式。對調控盾纖蟲包囊形成與包囊解脫相關基因的研究是阻斷其細胞分化關鍵基因的表達，抑制其生長、分化的前提。本研究擬通過對環境條件的控制實現對盾纖蟲包囊形成與解脫的高效誘導，套用RNA-seq技術在轉錄組水平上研究盾纖蟲營養期和休眠期基因表達的變化，以期尋找並克隆出影響休眠包囊形成的關鍵基因，以RNAi技術誘導盾纖蟲形成包囊的關鍵基因沉默，觀察基因沉默後的表型變化,注釋相關基因的功能,了解其相互作用的方式，力圖闡明盾纖蟲營養期與休眠期細胞轉化的機理，及套用RNAi方法對盾纖蟲的關鍵基因表達進行干擾，從而達到抑制盾纖蟲的生長與細胞分化的目的，為水產動物纖毛蟲病的防制策略提供新的思路。

結題摘要

因盾纖蟲病而造成海水養殖動物大量死亡的事件時常發生，在工廠化養殖的鮃鰈魚類中尤為嚴重。有關盾纖蟲如何應對極端環境的細胞結構及分子機理方面的研究明顯缺乏。 本項目通過對幾種盾纖類纖毛蟲種群生長動力學的研究，初步闡明了營養和溫度條件對其種群增長的影響，在研究中發現水滴偽康纖蟲能在低溫和營養條件不好時形成休眠包囊，進一步對包囊形成的最適條件進行了探索，發現在18℃菌液培養基中培養3d後，置於4℃，水滴偽康纖蟲包囊的誘導率最高達可達60%以上。通過掃描電鏡和透射電鏡觀察了水滴偽康纖蟲的營養細胞和休眠細胞的結構，明確了休眠包囊壁的結構及內部胞器的變化情況，初步判斷該休眠包囊為“毛基體非吸收型”包囊。 套用Illumina Hiseq 2500平台對水滴偽康纖蟲進行了高通量轉錄組測序，基於數字表達譜分析了營養細胞和休眠細胞的基因表達差異。獲得水滴偽康纖蟲unigene 64381個，其中24951基因個得到注釋，共有 17962 個unigene得到GO歸類注釋，有7081個unigene注釋到相應的通路之下，得到CDS 935個，預測得基因ORF 2157個。數字表達譜的數據分析表明，營養期和休眠期水滴偽康纖蟲各樣品均產生了1200萬以上的clean reads，產生的表達數據覆蓋了至少18503個unigene。在休眠包囊中337個基因顯示出明顯的上調，110個基因出現了顯著的下調。對差異基因進行GO富集後表明上調基因在生物學過程中的代謝過程和與氮複合體代謝相關的基因得到了較為顯著富集，在分子功能類別中，氧化還原酶活性得到最多的富集基因。在KEGG代謝通路的分析中，有關鞭毛裝配的富集程度最高，雙成份系統和丙氨酸，亮氨酸和異亮氨酸降解通路所富集的基因數最多。由於下調的110個基因中得到注釋的基因數太少且大部分的基因功能尚不明確，無法進行GO和KEGG的富集分析，因此，盾纖類的基因功能研究還需要進行更多的深入工作。 構建了水滴偽康纖蟲β微管蛋白基因、ATP合成酶基因、熱休克蛋白90基因和一種蛋白激酶基因的RNAi表達載體。餵食法干擾結果表明，β微管蛋白基因、ATP合成酶基因的RNA干擾具有一定的致死效應，而熱休克蛋白基因和一種蛋白激酶基因的qPCR結果表明，其mRNA的表達量有不同程度的下調，但在表型上未見顯著的改變。這些初步結果可為篩選RNA干擾致死表型基因奠定基礎。