《RNA干擾沉默糖原合成激酶3β對tau蛋白磷酸化的作用研究》是依託山東大學，由邊紅擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：RNA干擾沉默糖原合成激酶3β對tau蛋白磷酸化的作用研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：邊紅
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
阿爾茨海默病(AD)是以進行性認知功能障礙為特徵的神經變性疾病，老年斑和神經元纖維纏結(NFT)是其特徵的病理性損傷。異常磷酸化的tau蛋白構成NFT的核心，目前認為tau蛋白過磷酸化使微管穩定功能受損、螺旋狀纖絲（PHF）形成及神經元丟失。因此阻斷tau蛋白過磷酸化應是AD治療的有效途徑之一。有研究證明糖原合成激酶-3β（GSK-3β）是導致tau蛋白過磷酸化的重要激酶之一。本研究通過構建穩定轉染靶向GSK-3β的siRNA真核表達載體的人SH-SY5Y細胞系，探討在細胞水平對tau蛋白磷酸化作用的影響。通過AD大鼠模型的建立，探討siRNA沉默GSK-3β在體外實驗對海馬神經元病理是否有影響，是否抑制tau蛋白過磷酸化，進一步了解AD的發病機制，為探索AD基因治療途徑提供理論依據。
結題摘要
該課題從細胞水平及動物實驗水平探討了RNA干擾沉默糖原合成激酶3β對tau蛋白磷酸化的影響。創新性地構建靶向GSK-3β的慢病毒表達載體，經酶切和測序鑑定，將慢病毒重組載體與包裝載體共轉染293T細胞，獲得純化濃縮病毒液，侵染SH-SY5Y細胞，採用綠色螢光示蹤觀察細胞的轉染情況，利用qRT-PCR法檢測GSK-3βmRNA，Western blot法檢測GSK-3β、tau 蛋白及磷酸化tau 蛋白p-Tau(Ser 396)，p-Tau(Ser 404)，p-Tau(PHF-6)的表達水平。結果表明慢病毒介導的RNA干擾沉默GSK-3β基因在細胞水平可以降低tau蛋白磷酸化水平。套用APP/PS1雙轉基因AD小鼠，設慢病毒干擾組、空載體組、空白對照組，相同遺傳背景的小鼠作為陰性對照組，雙側海馬注射GSK-3β慢病毒載體，套用水迷宮實驗進行小鼠學習記憶能力檢測，HE染色觀察海馬區神經元形態結構變化，免疫組織化學方法檢測海馬區tau及磷酸化tau蛋白的表達，Western blot 方法檢測海馬區tau及磷酸化tau蛋白的表達。成功發現慢病毒干擾組轉基因小鼠學習記憶能力較空載體及空白對照組明顯改善。HE染色顯示慢病毒組海馬體形態與陰性對照組無明顯差別。與空白對照組相比，tau 蛋白及磷酸化tau 蛋白水平均明顯降低。成功構建了慢病毒介導的GSK-3β基因穩定沉默表達的SH-SY5Y細胞系，證明了慢病毒介導的RNA干擾沉默GSK-3β能夠降低tau蛋白和磷酸化tau蛋白水平，改善阿爾茨海默病雙轉基因小鼠學習記憶能力。進一步闡明GSK-3β在AD發病機制中的作用，為探索AD基因治療途徑提供理論依據。申請發明專利一項（公開號：CN102703508A），核心期刊（修稿）兩篇。
