《RASSF6-KRAS協同抑制胃癌發生與進展分子機制研究》是依託上海交通大學，由溫玉剛擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：RASSF6-KRAS協同抑制胃癌發生與進展分子機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：溫玉剛
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
課題組前期通過多平台全基因組掃描及生物信息學分析，篩選出新的胃癌相關基因RASSF6。經qPCR、免疫印跡驗證提示93.75%胃癌組織RASSF6表達顯著下調；生存分析表明RASSF6下調還與腫瘤進展密切相關。Allen採用基因共轉染等研究發現RASSF6直接與K-RAS相互作用，誘導肺癌細胞凋亡、抑制NF-κB通路；Ikeda則發現RASSF6引起Hela細胞凋亡不需與K-RAS結合。由此我們推測：RASSF6可能通過與K-RAS結合併調控NF-κB活性誘導細胞凋亡，抑制胃癌發生及進展。因此，本項目擬採用大樣本胃癌組織晶片、基因轉染、SiRNA、裸鼠體內成瘤等體內外、正反向調節實驗探討RASSF6抑癌作用；免疫共沉澱、ChIP、共聚焦顯微鏡、雙螢光素酶實驗檢測RASSF6、K-RAS有無協同作用，闡明其抑癌機制。本研究可為胃癌治療提供新的基因靶點，指導新的抗腫瘤靶向藥物研發。
結題摘要
1. RASSF6在胃癌發生髮展過程中的作用：（1）構建大樣本胃癌組織晶片，免疫組化檢測發現胃癌組織RASSF6蛋白表達較對應正常黏膜顯著下調，RASSF6低表達與腫瘤分期、分化密切相關；轉移淋巴結組織RASSF6蛋白表達較原發性腫瘤組織更低，RASSF6陰性患者總生存期和無病生存期較RASSF6陽性者明顯降低，下調的RASSF6表達是胃癌術後獨立預後因素。（2）選擇RASSF6低表達細胞株SGC7901，採用慢病毒轉染構建RASSF6穩定過表達胃癌細胞株。體外實驗表明過表達RASSF6明顯抑制SGC7901細胞增殖，減少細胞平板克隆和軟瓊脂克隆形成數目，降低細胞遷移和侵襲能力；促進SGC7901細胞周期阻滯，誘導細胞凋亡；體內實驗顯示RASSF6穩定過表達組裸鼠皮下成瘤的體積及重量均明顯小於對照組。2. 生物信息學分析提示miR-181a-5p可作為RASSF6的一個新型調節因素。體內外功能試驗提示miR-181a-5p的異常高表達或者沉默表達能分別促進或者抑制胃癌細胞的增殖、克隆形成、細胞周期轉變、侵襲轉移和上皮間質轉化。miR-181a-5p通過激活RASSF6調節的MAPK信號通路而起致癌miRNA的作用，並可被RASSF6的過表達或沉默表達部分逆轉。臨床研究發現，miR-181a-5p的高表達預示著胃癌病人的不良預後，特別是合併RASSF6的低表達。提示在胃癌中miR-181a-5p可通過直接抑制RASSF6的表達而起到致癌miRNA的作用。3.（1）RASSF6下游功能基因的表達譜晶片篩選 ：通過Affymetrix 表達譜晶片分析RASSF6 過表達前後差異表達的基因，獲得RASSF6下游的功能基因待研列表，通過生物信息學分析獲得與RASSF6 相關的細胞信號通路。（2）RASSF6下游功能基因的個性化篩選：在差異表達基因的列表中，初選30個A類基因（新功能基因）在待研細胞中進行qPCR預實驗，然後選擇20個高表達基因進行RNAi HCS高內涵細胞功能學篩選實驗，標記為B基因，作為系統對照實驗, 進行HCS 篩選實驗和後繼實驗。（3）下游功能基因的細胞功能學實驗：針對HCS篩選所獲的RASSF6下游的新功能基因PCDHGA9，並分析其對胃癌細胞功能的影響，發現干擾PCDHGA9基因表達可抑制胃癌細胞的增殖，後續將對這一作用機制進行深入研究。
