RANTES參與附睪管腔酸性微環境調控的作用和機制

《RANTES參與附睪管腔酸性微環境調控的作用和機制》是依託中國人民解放軍第四軍醫大學，由李臻擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：RANTES參與附睪管腔酸性微環境調控的作用和機制
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：李臻
• 依託單位：中國人民解放軍第四軍醫大學

中文摘要

精子在附睪中經歷一系列成熟變化而獲得運動和受精能力,其中附睪管腔液的酸性環境對保持精子能夠處於靜息狀態並預防頂體酶的過早激活至關重要。新近研究發現，附睪上皮中的亮細胞泵出質子而維持管腔液酸性環境，這一過程受附睪尾部基細胞釋放的NO刺激，但調控機制仍不清楚。我們的前期工作表明，RANTES主要表達於人附睪尾部的基細胞，而且可特異性促進基細胞釋放NO，提示RANTES可能參與基細胞和亮細胞之間的串話調節。本項目擬用多光子雷射掃描顯微鏡技術，從三維水平觀察RNATES與其受體在基細胞的相互作用；在附睪上皮細胞原代培養和管腔微灌注兩個層次上，探討RANTES/NO通路對基細胞與亮細胞的串話調節；以及利用在體RNA干擾和局部給予抑制劑或阻滯性抗體的方法封閉RANTES，觀察對附睪管腔酸性環境的影響。全面認識RANTES在附睪酸性微環境調節中的功能，對進一步闡明精子成熟的調控機制具有重要的意義。

結題摘要

附睪上皮細胞之間存在複雜的網路關係，共同維持管腔液的酸性環境，保持精子處於靜息狀態。其中基細胞可以感受附睪管腔內ANGII的濃度變化，並通過NO調節鄰近亮細胞v-ATPase泵運H+，以達到維持附睪管腔液酸性微環境的目的。我們的前期研究表明，受激活調節正常T細胞表達和分泌因子RANTES主要表達於人附睪上皮的巨噬細胞, 且在附睪尾部表達較多。本研究首先用免疫組化及螢光雙標技術觀察RANTES及其受體在人和大鼠附睪的共定位；然後建立大鼠附睪微灌注模型，在附睪尾部給予1 μΜ RANTES刺激，對照組以pH 6.8的PBS代替，作用30分鐘後取材，利用Real time-PCR、Weternblot、免疫螢光共聚焦技術檢測V-ATPase以及iNOS在附睪上皮的表達變化；最後建立SD大鼠輸精管切除模型以破壞附睪管腔酸性微環境，進一步利用Real time-PCR、Western-blot、免疫螢光檢測V-ATPase的表達變化、放免法檢測附睪組織勻漿液上清內ANGII濃度的變化，Real time-PCR、Western-blot檢測ANGII受體AGTR2、RANTES、CCR1、CCR5以及iNOS表達的變化。結果：免疫組化結果顯示RANTES、CCR1、CCR5在人和大鼠附睪頭、體、尾均有表達，且在尾部表達較強，免疫螢光雙標顯示RANTES表達於人和大鼠附睪上皮的巨噬細胞，CCR1、CCR5和RANTES在人和大鼠附睪頭、體、尾均有共定位信號。附睪尾部微灌注RANTES刺激後，與對照組相比，大鼠附睪組織iNOS、V-ATPase表達明顯增高，免疫共聚焦結果進一步證實附睪巨噬iNOS表達增強，亮細胞頂膜V-ATPase聚集明顯增多。輸精管切除術後8周，手術組附睪管壁變薄，管腔增大、不規則，附睪液pH值升高；附睪尾部V-ATPase表達明顯降低，附睪亮細胞頂膜V-ATPase聚集減少；附睪組織內ANGⅡ濃度顯著下調，AGTR2、RANTES、CCR1、CCR5及iNOs的表達均降低。結論：RANTES與受體CCR1、CCR5在人和大鼠共表達於附睪上皮巨噬細胞，RANTES可能在ANGII的刺激下，通過與受體結合促進巨噬細胞釋放NO，參與基細胞與亮細胞的串話機制，從而協助維持附睪管腔酸性環境的平衡。