《PIAS-NY在精子發生中的作用機制》是依託揚州大學，由鄭英擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：PIAS-NY在精子發生中的作用機制
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：鄭英
- 依託單位：揚州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
前期工作中我們克隆了PIASx基因一個新的剪接體，該基因僅表達於成人睪丸及胰腺中。套用酵母雙雜交技術，我們發現了一個新的與其相互作用的DNA解旋酶RUVBL2。本課題試圖在此基礎上進一步探討PIAS-NY在精子發生過程中的作用機制。首先運用螢光素酶實驗明確PIAS-NY對STAT4及AR轉錄活性的調節，運用SUMO化法檢測PIAS-NY是否具有SUMOE3連線酶活性。其次構建一系列PIAS-NY及RUVBL2截短片段及缺失突變體質粒，套用酵母雙雜交及免疫共沉澱法確定兩者相互作用的核心區域。利用螢光素酶實驗檢測PIAS-NY對RUVBL2轉錄活性的調節。套用SUMO實驗檢測PIAS-NY與RUVBL2 SUMO化之間的關係。構建PIAS-NY過表達及抑制表達的細胞系，觀察其對RUVBL2表達的影響。通過這些研究有望闡明PIAS-NY基因在精子發生過程中的分子調控機制。
結題摘要
PIAS2是PIAS蛋白家族中特異性高表達於睪丸組織中的一個亞型，PIAS-NY是前期工作中發現的PIAS2的新成員之一，其在精子發生中的作用尚不清楚。為探討PIAS-NY在精子發生中的作用機制，我們用酵母雙雜交的方法篩選到PIAS-NY的一個相互作用蛋白-RUVBL2。本項目研究了精子發生中PIAS-NY與RUVBL2的相互作用機制。首先分析了PIAS-NY及其相互作用蛋白RUVBL2、RUVBL1在睪丸組織中的表達情況：套用分子克隆的方法，構建了原核表達質粒，表達和純化了PIAS-NY的原核蛋白，並套用該蛋白免疫小鼠，製備了PIAS-NY的多克隆抗體。套用免疫組織化學法分析了PIAS-NY、RUVBL2及RUVBL1在不同發育期睪丸組織中的表達情況，結果顯示，PIAS-NY表達於各級生精細胞中，特別是在初級精母細胞中表達水平最高。同時，RUVBL2和RUVBL1也主要表達於初級精母細胞中，提示PIAS-NY，RUVBL2及RUVBL1三種蛋白在初級精母細胞中發揮重要的調節作用。第二，套用酵母雙雜交及免疫共沉澱技術明確了PIAS-NY與RUVBL2之間的相互作用：通過直接酵母雙雜交實驗，證實了在酵母細胞中PIAS-NY可以與RUVBL2相互作用；通過免疫共沉澱技術，證實在哺乳動物細胞中外源性和內源性的PIAS-NY和RUVBL2均能相互作用，PIAS-NY也能與RUVBL1相互作用；套用亞細胞定位的方法證實PIAS-NY和RUVBL2能共同定位於哺乳動物細胞核內從而發生相互作用。第三，通過酵母雙雜交技術確定了RUVBL2與PIAS-NY相互作用的最小區域。結果顯示PIAS-NY 的C末端RLD結構域為其RUVBL2相互作用的最小區域。而RUVBL2蛋白與PIAS-NY作用的最小區域為第二個Domain I。第四，通過SUMO化修飾實驗來研究PIAS-NY對RUVBL2的調控作用機制，結果提示PIAS-NY可能通過非SUMO化修飾的方式與RUVBL2相互作用。第五，通過構建PIAS-NY過表達小鼠精母細胞系，探討了PIAS-NY與RUVBL2的相互作用機制。通過Western Blot定量分析發現，過表達PIAS-NY蛋白能增加RUVBL2和RUVBL1的蛋白表達量。上述研究結果為揭示PIAS-NY在精子發生中的作用提供了重要的線索。
