《Not1蛋白調節粗糙脈孢霉生物鐘的機制》是依託蘇州大學，由黃國存擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：Not1蛋白調節粗糙脈孢霉生物鐘的機制
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：黃國存
- 依託單位：蘇州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
在分子水平上，真核生物鐘的負反饋迴路是由正性成份和負性成份組成。過去的研究多集中在對負性成份蛋白的降解途徑，但對作為轉錄因子的正性成份蛋白的穩定性調節研究較少。本項目用粗糙脈孢霉（Neurospora crassa）作為材料，研究和生物鐘正性成份WC-1和WC-2緊密結合的新蛋白Not1參與生物鐘調控的分子機制。 圍繞負反饋迴路，搞清Not1是通過轉錄還是轉錄後調節參與生物鐘的正常運行。探討Not1對生物鐘相位(phase)的影響是否涉及光受體蛋白VVD。另外，對和Not1存在於同一複合物中的其它蛋白，例如Ccr4、Caf1、Caf40和Not5等，初步了解其功能是否也與生物鐘有關。本研究將揭示Not1或Not-Ccr4複合物對生物鐘調控的內在機制。由於真核生物鐘的工作原理在不同物種間大致相似，研究結果會對哺乳動物，果蠅和植物等生物鐘正性成份蛋白的研究起到促進作用。
結題摘要
在分子水平上，脈孢菌的生物鐘是由WCC和FRQ組成的負反饋環路組成，其中WC-1和WC-2形成的複合體（WCC）激活frq基因的轉錄。Not1能夠和WCC結合在一起，並且對維持WC-1和WC-2水平至關重要。not1轉錄水平呈現晝夜節律變化，和frq基因轉錄水平相位一致。not1基因敲降導致WC-1和WC-2蛋白和磷酸化水平降低，轉錄活性提高和生物鐘相位延遲。蛋白純化試驗表明Not1存在於Ccr4-Not複合物中。ccr4是一個生物鐘調控基因，受WCC直接調控。ccr4基因敲降導致生物鐘相位延遲，節律周期變長。 由於Not1對脈孢菌生物鐘調控機理並不清楚，另外Not1在真核生物中保守相似，接著我們將利用哺乳動物細胞來研究其調控機理。在哺乳動物的負反饋環路中，正向組分蛋白複合體CLOCK-BMAL1激活負向組分蛋白per和cry的轉錄，PER和CRY蛋白形成複合體進入細胞核內抑制CLOCK-BMAL1的活性。在哺乳動物中，真菌Not1蛋白的同源蛋白命名為CNOT1。 我們發現CNOT1能夠分別與CLOCK和BMAL1結合，導致它們的磷酸化水平提高和蛋白穩定性增加。 蛋白免疫沉澱試驗表明，過量表達CLOCK和BMAL1能夠結合細胞內源的PKA激酶，並且CNOT1初進PKA與CLOCK和BMAL1的結合。在小鼠肝臟中，我們也看到了CNOT1與CLOCK和BMAL1的結合，並且這種蛋白相互作用具有節律，在ZT8結合多，在ZT16結合少，從而導致在ZT8時間點，CLOCK和BMAL1顯示更高的PKA磷酸化水平。利用CRISPR-Cas9技術，我們得到PKA-Cα基因敲除的突變體。PKA-Cα基因敲除的突變體的節律周期變長；與此相反，過量表達PKA的U2OS細胞的節律周期縮短。 除了CLOCK和BMAL1以外，PER和CRY也是哺乳動物生物鐘的核心蛋白。 在HEK293T細胞中分別瞬時表達Flag-PER2和HA-CRY2蛋白，結果顯示，PKA底物磷酸化抗體只能識別PER2, 而不能識別CRY2，說明PER2和CLOCK與BMAL1一樣，是PKA的磷酸化靶蛋白，並且CNOT1也能促進PKA介導的PER2磷酸化，蛋白降解試驗證實PKA磷酸化增加了PER2蛋白的穩定性。 我們的研究結果表明CNOT1和PKA結合，共同調控真菌和小鼠生物鐘的正常運行。
