《Nanog和Oct4促耳蝸支持細胞轉化為毛細胞的相關研究》是依託中國人民解放軍第四軍醫大學，由喬莉擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：Nanog和Oct4促耳蝸支持細胞轉化為毛細胞的相關研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：喬莉
- 依託單位：中國人民解放軍第四軍醫大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
哺乳動物耳蝸毛細胞為特化終末細胞，損傷後的再生仍是世界性難題。因此，發現新的促毛細胞再生的調控基因，對於感音神經性耳聾的基因治療具有重要意義。本實驗室前期研究結果表明：Nanog和Oct4基因對維持耳蝸幹細胞的自我更新及在耳蝸發育過程中扮演著重要角色。我們構想能否利用Nanog和Oct4的這一特性，使哺乳動物耳蝸支持細胞在特定環境作用下最終分化為耳蝸毛細胞。因此，本項目擬利用體內外實驗，將Nanog和Oct4的腺病毒表達載體轉染至耳蝸支持細胞，在慶大黴素、促毛細胞分化因子維甲酸及耳蝸微環境的共同作用下，通過Corti器培養，掃描電鏡及免疫組化等方法評估其對耳蝸支持細胞分化為毛細胞的能力及方式的影響，從而進一步明確Nanog和Oct4基因促耳蝸支持細胞轉分化的作用，以期尋找毛細胞再生的新途徑。
結題摘要
鳥類、非哺乳動物類脊柱動物、兩棲動物等，內耳毛細胞損傷後可通過相關分子和信號通路的調控下，由相鄰支持細胞重新進入細胞周期，通過有絲分裂的形式形成新生毛細胞。然而，成年哺乳動物耳蝸毛細胞受損後不能再生。研究表明新生小鼠的耳蝸支持細胞仍具有有絲分裂和轉分化為毛細胞的能力，但是這種能力隨著年齡的增長、耳蝸發育的不斷成熟以及細胞周期負性抑制因子p27Kip1表達的不斷下降而降低。我們相信哺乳動物耳蝸毛細胞在特定的條件下，可通過調控相關的分子和信號通路，生成新的毛細胞。我們的研究思路是：在耳蝸中轉入多潛能相關基因Nanog和Oct4，即使其分化為多潛能性的細胞；利用耳蝸細胞成長發育的特定微環境促使其定向分化，期待為哺乳動物耳蝸毛細胞再生提供新的思路。 本實驗聯合套用硫酸卡那黴素和呋塞米構建了快速藥物性耳聾模型，此模型可用於研究Nanog基因在耳蝸毛細胞再生中作用的，並套用免疫螢光等方法對造模結果進行了鑑定；套用硫酸卡那黴素連續腹腔注射，構建了用於研究Nanog基因對於耳蝸毛細胞作用的慢速藥物性耳聾模型，並套用免疫螢光、掃描電鏡等方法對造模結果進行了鑑定。構建含Nanog基因的腺病毒表達載體Adv-Nanog-EGFP，並套用兩種不同的耳蝸顯微注射方法（中介注射和鼓階注射），對轉染的綠色螢光蛋白的分布進行了檢測，並檢測了兩種注射方法對大鼠聽力的影響。接下來，我們套用耳蝸中介注射的方法，在快速藥物性耳聾模型建立後4天，通過耳蝸顯微注射給予Adv-Nanog-EGFP，觀察Nanog基因在毛細胞再生過程中的作用。套用慢速藥物性耳聾模型，通過耳蝸顯微注射術將Adv-Nanog-EGFP 注射入大鼠耳蝸鼓階內。在腺病毒顯微注射後14天，套用基底膜鋪片和掃描電鏡等方法觀察耳蝸毛細胞形態及超微結構的變化。 在我們的模型中，耳蝸所有的外毛細胞均死亡，而支持細胞大部分存活，滿足我們對於耳蝸毛細胞再生研究的要求；而多次硫酸卡那黴素腹腔注射的結果提示，耳蝸底轉毛細胞基本消失，中轉可見外毛細胞散在消失，而在頂轉幾乎未見到毛細胞消失。此模型滿足我們對於耳蝸毛細胞保護作用的研究。通過比較兩種注射方式的綠色螢光蛋白分布及對聽力的影響，我們的結果提示：耳蝸中階注射的聽力損傷大於耳蝸鼓階途徑，但耳蝸中階注射的腺病毒感染效率遠遠大於耳蝸鼓階途徑。在套用耳蝸毛細胞慢速損傷模型中，Adv-Nanog-EGFP注射組
