《NSCLC癌幹細胞TLR9的表達特點、信號級聯與乾性維持作用》是依託同濟大學，由任濤擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：NSCLC癌幹細胞TLR9的表達特點、信號級聯與乾性維持作用
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：任濤
- 依託單位：同濟大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
近來癌幹細胞(CSCs)對腫瘤進展的影響凸顯。TLR9信號通路介導促進並維繫NSCLC的惡性徵，我們的後續工作發現TLR9不僅特異高表達於NSCLC-CSCs並維持CSCs的自我更新能力，且其下游分子多具乾性調節潛能，故推測TLR9通路參與NSCLC-CSCs的乾性維持。為此，課題組擬從不同病理類型的NSCLC臨床標本/細胞系中分離CSCs，①獲得CD166+/133+/44+或ALDH+等不同標識的幹細胞亞群並行乾性鑑定，②用實時定量 PCR或流式細胞儀檢測TLR9和常見乾性基因的表達及其分化前後的動態變化,③觀察TLR9基因敲入/敲減及其信號激活對CSCs自我更新、化療抵抗和成瘤性的影響,④晶片技術篩選TLR9信號級聯,並用WB或RT-PCR等進行驗證以遴選目標靶分子,⑤驗證目標靶分子干預對CSCs乾性的抑制作用。研究旨在完善TLR9的信號功能並探索CSCs的調控機制與治療措施。
結題摘要
腫瘤幹細胞具有自我更新、多向分化以及藥物抵抗、高致瘤性和轉移潛能，被認為是導致腫瘤復發與惡化的主要原因。TLR9以及下游信號分子NF-κB、PI3K、AKT、mTOR、CXCR4、MAPK均與癌幹細胞的乾性維持密切相關。本課題藉助流式細胞技術，從不同病理類型的NSCLC患者手術標本或腫瘤細胞系中分離獲得NSCLC-CSCs亞群，用Real-Time PCR、Western-Blot和流式細胞術檢測比較分離的幹細胞群、非幹細胞群中TLR9的表達，在幹細胞、非幹細胞群中加入TLR9激活配體CpG DNA，觀察加入TLR9激動劑後對幹細胞自我更新、分化的影響，發現幹細胞群中TLR9的表達明顯高於非幹細胞群，TLR9激動劑CpG ODN促進幹細胞自我更新、抑制幹細胞的分化。從NCI-H460、SPCA-1中分離的肺癌幹細胞，用ShRNA干擾的方法，獲得TLR9穩定低表達幹細胞克隆，用懸浮球形成實驗觀察TLR9表達下調後幹細胞的自我更新能力，Transwell方法觀察細胞的侵襲性改變，流式細胞檢測細胞周期的分布，TUNEL法檢測細胞凋亡情況，MTS法檢測TLR9下調後幹細胞對化療藥物順鉑、阿黴素的敏感性改變情況，建立裸鼠移植瘤模型，觀察TLR9下調後幹細胞成瘤能力改變。結果發現TLR9基因下調後，形成的細胞懸浮球明顯縮小、侵襲性減弱，S期細胞比例減少，凋亡細胞增加，對化療藥物順鉑、阿黴素敏感性增強，裸鼠體內成瘤能力減弱。ShRNA干擾方法下調TLR9的表達，觀察TLR9下調後其他幹細胞乾性基因：Oct-4，Sox2，Gli1，Nanog，Notch1,β-catenin表達的改變，檢測耐藥基因ABCB1、ABCC1、ABCG2表達的改變，檢測細胞周期相關基因Cyclin B1、CDK1、BCL2、TRET、Survivin表達的改變，發現TLR9下調後，乾性基因Gli、Notch1、β-catenin明顯下調，Cyclin B1、CDK1表達下降，耐藥基因ABCB1、ABCC1、ABCG2明顯下調。TLR9是肺癌幹細胞乾性維持的重要因子，有可能成為肺癌幹細胞功能調控的關鍵靶位，進而控制肺癌的復發與轉移。
