《N-脫氧核糖轉移酶Ⅱ的定向進化及其生物催化功能研究》是依託清華大學，由王洪鐘擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：N-脫氧核糖轉移酶Ⅱ的定向進化及其生物催化功能研究
- 依託單位：清華大學
- 項目負責人：王洪鐘
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
N-脫氧核糖轉移酶II（NDT）能夠催化不同鹼基之間的脫氧核糖轉移反應，具有高度的β-位選擇性，用於製備臨床廣泛套用的脫氧核苷類藥物及其中間體。前期基礎研究表明，該酶對較高濃度的底物和溶劑耐受力弱，酶活低且不穩定，不適於催化底物水溶解性差的反應，且因終產物濃度低難於規模化套用。本課題首次採用易錯PCR和定點突變相結合的方法，通過比對不同種乳酸菌NDT殘基組成差異、活性和空間位置變化以及計算機輔助模擬，確定候選突變位點及替換胺基酸，定向進化改造和篩選獲得活性和穩定性高、對底物和溶劑耐受力強的重組菌。其次，採用自誘導系統，拋棄價格昂貴和毒性大的IPTG，自動誘導啟動子轉錄表達，提高酶表達量。最後，探討NDT催化製備地西他濱和其他不同鹼基類似物過程中功能參數變化規律和調控機制。課題進一步完善生物催化法製造核苷類似物的理論體系與方法，達到製備出穩定性和耐受性更佳的脫氧核苷全細胞催化劑的目的。
結題摘要
N-脫氧核糖轉移酶 II（NDT）能夠催化脫氧核糖在不同鹼基之間的轉移，可以套用於合成多種脫氧核苷類藥物和中間體。NDT對2'-脫氧核苷有高度底物特異性，許多抗病毒的核苷類似物帶有糖基修飾，NDT催化合成這類產物的效率極低。而且該酶對有機溶劑耐受力弱，不適於催化底物水溶解性差的反應。因此需要對酶進行突變改造，完善蛋白表達與催化反應條件，達到製備出底物識別範圍更廣、穩定性更強的催化劑的目的。 本課題通過計算機輔助模擬，確定了瑞士乳桿菌來源的N-脫氧核糖轉移酶 II（LhNDT）的候選突變位點，構建了LhNDT突變體庫。建立了兩種酶聯顯色篩選體系：黃嘌呤氧化酶-辣根過氧化物酶偶聯體系用於隨機突變體庫篩選，篩選得到一株N124A突變體, 反應1h催化合成克拉屈濱的轉化率降低了2.7倍以上；NDT-CDA酶聯顯色體系套用於飽和突變體庫篩選，篩選得到一株G10S突變體，反應12h合成2',3'-二脫氧胞苷的轉化率達到11.9%，是野生型NDT的5.2倍。上述結果表明NDT-CDA酶聯篩選體系背景小，準確度高，可以套用於多種有醫藥價值的胞苷類似物催化反應的檢測。在蛋白表達方面，本課題拋棄價格昂貴、毒性大的IPTG，採用自誘導培養基誘導NDT蛋白表達，使菌體密度增加了3倍左右，提高了酶表達量。在催化反應條件方面，通過全細胞非水相催化，實現了利用難溶底物催化合成核苷類似物；最佳化了催化條件，利用全細胞催化合成2'-脫氧胞苷、5-雜氮脫氧胞苷（地西他濱）、2'-氯-2'-脫氧腺苷（克拉屈濱）、2',3'-二脫氧胞苷（扎西他濱）等，均獲得了較高的轉化率。 本研究首次建立了NDT突變體高通量篩選體系，為NDT底物特異性改造提供了有效方法；通過突變改造，大大提高了NDT對2',3'-二脫氧核苷的催化活性。使用表達NDT的全細胞製備套用廣泛的核苷類似物，與傳統的化學工藝相比，反應步驟少，產物立體選擇性高，純化簡單；探究了非水相全細胞催化和細胞固定化條件，為NDT的工業化套用奠定了基礎。
