Mst1/Beclin1軸對肝星狀細胞自噬的調控及其機制研究

《Mst1/Beclin1軸對肝星狀細胞自噬的調控及其機制研究》是依託華中科技大學，由陳西柳擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：Mst1/Beclin1軸對肝星狀細胞自噬的調控及其機制研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：陳西柳
• 依託單位：華中科技大學

中文摘要

肝纖維化是慢性肝臟疾病過度創傷修復的過程，可進展為終末期肝病。肝臟損傷後肝星狀細胞的活化增殖導致肝纖維化的發生。近年發現自噬在活化肝星狀細胞、促進其轉化為成纖維細胞中起了重要作用。本課題組前期研究發現肝臟慢性損傷能夠同時誘導肝星狀細胞發生自噬與凋亡現象，選擇性抑制肝星狀細胞的自噬活性能夠提高肝星狀細胞的凋亡比率，促進細胞的程式性死亡。在此基礎上我們推測：慢性肝損傷時肝星狀細胞逃避凋亡與誘發自噬之間存在共同通路。Beclin1能參與細胞的凋亡及自噬兩條途徑的調控過程，而Mst1能促進Beclin1與Bcl-2/Bcl-xL相結合，促進細胞凋亡、抑制細胞的自噬。故本項目擬以四氯化碳誘導的肝星狀細胞和二甲基亞硝胺誘導的大鼠為模型，檢測Beclin1及Mst1對肝星狀細胞凋亡、自噬、增殖的影響，確定Mst1/Beclin1軸對肝星狀細胞自噬的調控作用，為找到有效的抗肝纖維化藥物作出有意義的探索。

結題摘要

背景：四氯化碳誘導小鼠形成纖維化的肝星狀細胞中自噬小體增多；用自噬抑制劑作用於HSC能降低其增殖。Beclin1可雙向調控細胞凋亡與自噬。Mst1能磷酸化Beclin1，抑制細胞自噬，促進細胞凋亡。本實驗擬探討Mst1能否通過磷酸化Beclin1，促進HSC凋亡，抑制其自噬，減少肝纖維化形成。 內容：1.四氯化碳誘導HSC自噬與凋亡的研究：以不同濃度四氯化碳誘導HSC，運用流式細胞儀、透射電鏡觀測HSC自噬以及凋亡水平，通過Western-blot、免疫螢光、實時定量PCR、螢光原位雜交法等檢測Beclin1、自噬相關蛋白家族的表達。2.Beclin1在HSC自噬及凋亡過程中的作用：構建Beclin1表達質粒並轉染至HSC，分析Beclin1表達水平對HSC自噬及凋亡水平的影響。3.Mst1活性對HSC自噬與凋亡的影響：構建Mst1 siRNA及過表達質粒，通過RT-PCR、Western-blot檢測Mst1被抑制及過表達時Beclin1磷酸化水平，明確Beclin1是否為Mst1的作用底物；通過流式細胞儀、雷射共聚焦顯像等檢測Mst1對HSC自噬以及凋亡水平的影響；構建108位蘇胱氨酸突變的Beclin1異構體，與Mst1共轉染至HSC，Western-blot檢測磷酸化與非磷酸化Beclin1的水平，明確Mst1磷酸化Beclin1的作用靶點。4.Mst1活性對大鼠肝纖維化模型的影響：構建大鼠肝纖維化模型，注射Mst1過表達質粒，RT-PCR及Western-blot法檢測各相關蛋白表達水平、流式細胞儀檢測自噬、Tunnel法檢測凋亡，驗證Mst1活性在體內模型中對HSC自噬與凋亡水平的影響。 結果：四氯化碳處理HSC後，細胞凋亡無變化，自噬增多；Beclin1增加，磷酸化Beclin1減少，MST1減少。Beclin1過表達時細胞凋亡增加，自噬明顯增加。Mst1下調時beclin1明顯增加，細胞凋亡無變化，自噬明顯增多；上調時beclin1明顯減少，凋亡明顯增加，自噬減少。大鼠肝纖維化時，beclin1上升，磷酸化beclin1下降，HSC自噬增加，凋亡減少，Mst1過表達後，beclin1下降，磷酸化beclin1上升，自噬減少，凋亡增加。 意義：Mst1可能通過磷酸化Beclin1下調肝纖維化過程中HSC的活性，抑制自噬，促進細胞凋亡，從而達到保護作用。