基本介紹
- 中文名：胞內蛋白酶
- 外文名：Endoproteinase Lys-C
- 簡稱：Lys-C
簡介,用途,操作條件,實驗步驟,準備蛋白,酶重構,酶解反應,
簡介
胞內蛋白酶 Lys-C （ Endoproteinase Lys-C ）是一種賴氨酸蛋白酶，從產酶溶桿菌中分離得到，作為一種高純度蛋白酶，它能特異水解 Lys 的羧基端（與精氨酸相連時除外），可以產生比Trypsin多的酶解肽段，因此在蛋白質組學分析中有著很好的套用前景。
用途
用於酶解蛋白，該測序級的酶可單獨使用，也可以與其它蛋白酶一起使用，經過消化的蛋白可用於肽圖譜，也可用於通過肽質譜指紋印跡或 MS/MS 光譜匹配進行蛋白鑑定。
操作條件
Lys-C 在 pH 範圍 7.0-9.0 時活性最佳。消化反應即可在溶液中進行，也可在凝膠中進行。
實驗步驟
準備蛋白
為了達到好的酶解條件和完整的序列覆蓋度，通常情況下蛋白需要有效的溶解、變性並還原二硫鍵（烷基化）。可按照以下的最佳化步驟來進行：
1、溶解/變性： 溶解蛋白在 25mM Tris-HCl, 1mM EDTA
(pH 8.5)中.不易溶解或者需要變性以易於有效酶解的蛋白，可以在37°C條件下，在最小體積的變性劑6–8M 尿素或者 6M 鹽酸胍中溶解不超過1個小時 。
對於有些蛋白最好在此期間加熱到60°C（或者極端條件下95°C加熱15–20 分鐘）。如果不希望加熱，也可以在25mM Tris-HCl, 1mM EDTA (pH 8.5) 溶液中加入最小劑量的表面活性劑ProteaseMAX™ (約0.01–0.2%) 。
2、二硫鍵還原： 在溶解的蛋白中加入DTT （或者β-mercaptoethanol）使其最終濃度為 5mM； 50–60°C 下加熱20分鐘。
3、烷基化：為了還原蛋白，冷卻至室溫後加入碘代乙酸鈉（iodoacetamide，IAA）使其濃度為 15mM，在室溫下避光反應15 分鐘.
4、最後用25mM Tris-HCl, 1mM EDTA (pH 8.5) 稀釋尿素濃度至1M或者更少。
鹽酸胍的濃度則應稀釋至0.1M 或者更少，表面活性劑ProteaseMAX™ 的濃度稀釋至0.025%以下。
酶重構
Lys-C酶一般在HEPES, EDTA and raffinose等物質存在下凍乾保存。使用時套用雙蒸水復溶。
酶解反應
以Lys-C比蛋白1:100到1:20 (w/w) 的質量比例將酶加入到蛋白溶液中 37°C下孵育2-18小時，之後酶解反應可以加入0.5%的三氟乙酸中止。
