Lnc-NP調控ADSC成髓核中晚期分化中FoxA2/Shh信號通路的機制研究

《Lnc-NP調控ADSC成髓核中晚期分化中FoxA2/Shh信號通路的機制研究》是依託浙江大學，由李方財擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：Lnc-NP調控ADSC成髓核中晚期分化中FoxA2/Shh信號通路的機制研究
• 依託單位：浙江大學
• 項目負責人：李方財
• 項目類別：面上項目

項目摘要

幹細胞成髓核分化受限是退變椎間盤治療的瓶頸。人脂肪幹細胞(hADSC)成髓核分化具有時序性，而中晚期階段主要受FoxA1/2和Shh調控。lncRNA是幹細胞分化的重要調控因素。我們前期發現Lnc-NP和FoxA2同時高表達於成髓核中晚期分化的hADSC，Lnc-NP定位於胞漿，FoxA2是其結合蛋白；且Lnc-NP被RNAi干擾後成髓核分化將停滯在早期階段，髓核抗原和FoxA2表達也顯著下降。我們推測hADSC成髓核中晚期分化主要受Lnc-NP、FoxA2和Shh調控。故擬在體外闡明Lnc-NP、FoxA2和Shh間的交叉對話，建立一整套RNA研究體系，並藉助基因轉染獲得高成髓核分化的1ncRNA-hADSC；進而驗證異種異體移植成髓核分化後的1ncRNA-hADSC修復大鼠退變椎間盤的效果；闡明1ncRNA在hADSC成髓核中晚期分化中的作用，從而為椎間盤退變的治療提供新數據及新靶點。

結題摘要

基於脂肪組織的幹細胞（ADSC）療法有望治療椎間盤（IVD）變性，但誘導髓核（NP）樣分化的困難限制了其臨床套用。越來越多的研究證明，長鏈非編碼RNA（LncRNA）在幹細胞定向分化中起到了很重要的作用。我們期望以RNA測序為基礎，發現調控ADSC成髓核細胞分化的關鍵LncRNA，並研究其與相關信號通路、轉錄因子之間的調控機制，進而調控關鍵靶點，提高ADSC成髓核細胞分化的效率，以期後續能夠套用於臨床。研究內容、結果及數據主要包括：1、分離、純化、培養和鑑定人脂肪幹細胞（hADSCs），證實了hADSCs的成骨、成脂及成軟骨多向分化潛能；2、採用3D細胞微球的方法，在模擬椎間盤微環境情況下，採用改良成髓核誘導培養基培養hADSCs（髓核組）、改良成軟骨誘導培養基培養hADSCs（軟骨組），正常培養基培養hADSCs（正常組）；3、利用RNA-seq測序技術獲得了髓核組、軟骨組、正常組LncRNAs和mRNA的差異表達譜；4、利用已有資料庫及生信分析等篩選出了hADSCs成髓核分化的候選LncRNAs 25個；5、套用RT-PCR對篩選出的候選LncRNAs進行驗證，並最終篩選出差異最明顯的LncRNA，命名為LncNP；6、利用慢病毒將LncNP轉染到hADSCs中，獲得了過表達LncNP的成髓核定向分化的幹細胞LncNP-hADSCs；7、探索LncNP調控hADSCs成髓核分化的機制，同時發現FoxA2可通過shh通路促進成髓核分化；8、將預髓核分化的LncNP-hADSCs注射入SD大鼠的退變椎間盤內，發現其具有修復退變椎間盤的效果；9、發表SCI論文總計12篇，其中LncRNA相關綜述2篇，最高影響因子8.063分，5分以上5篇，部分成果參加了中國骨科相關的會議；10、培養博士生3名，碩士生2名；本項目總結了LncRNA在軟骨發育、病變、再生方面以及幹細胞分化領域的重要作用，並發表了兩篇相關的SCI文章，同時通過測序發現了促進hADSCs分化成髓核細胞的LncRNAs，命名為lncNP，利用慢病毒構建了過表達lncNP的hADSCs，其具有優良的成髓核細胞分化的能力，在體內研究中也展現出了修復退變椎間盤的效果，為未來幹細胞治療椎間盤退變的臨床醫學轉化研究奠定實時監控和個性化治療的理論基礎，對臨床治療具有一定指導意義。