INSR基因誘導性敲減II型糖尿病模型兔的建立及病理分析

《INSR基因誘導性敲減II型糖尿病模型兔的建立及病理分析》是依託上海交通大學，由陳學進擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：INSR基因誘導性敲減II型糖尿病模型兔的建立及病理分析
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：陳學進
• 依託單位：上海交通大學

項目摘要

本研究的目的是利用家兔轉基因克隆技術平台和shRNA載體構建技術，製作可誘導性表達INSR基因shRNA干擾片段的Ⅱ型糖尿病模型兔。首先構建含有四環素操縱子的H1啟動子和四環素操縱子結合蛋白TETR的表達質粒，導入neo基因作為體外篩選標記，然後把針對胰島素受體基因INSR的shRNA的片段連線到H1啟動子下游。干擾質粒經轉染成纖維細胞獲得轉基因細胞系。通過核移植技術獲得INSR基因shRNA干擾的克隆兔，並繁殖形成群體。在飼料中添加Doxycycline的情況下，降低轉基因家兔INSR基因mRNA的豐度和翻譯水平，導致由於INSR表達過低引起胰島素抵抗，引發Ⅱ型糖尿病。本研究的結果將為研究Ⅱ型糖尿病的致病機理和治療糖尿病導致的動脈粥樣硬化等心血管疾病和眼科疾病提供可靠的可誘導的疾病模型。

結題摘要

家兔糖尿病模型對於研究Ⅱ型糖尿病病理機制以及糖尿病並發的高脂血症、動脈粥樣硬化、視網膜病變的病理和治療藥物有較高的套用價值。我們通過分子設計，構建了可以由Dox誘導表達的RNA干擾載體，該載體含有shRNA表達框、四環素操縱子結合蛋白表達載體。 根據INSR基因的轉錄本，通過兩種不同的方式設計10對Sh-RNA，通過退火和酶切連線製作不同干擾載體。通過體外轉染成纖維細胞，在抗性篩選後轉基因細胞系克隆。經螢光分析和PCR鑑定獲得不同干擾片段的轉基因成纖維細胞克隆。以不同的轉基因成纖維細胞進行核移植和胚胎移植獲得INSR-shRNA轉基因克隆兔。INSR-RNAi轉基因克隆成纖維細胞能夠支持克隆胚胎髮育至囊胚階段，經過進一步的胚胎移植，可以獲得發育到期的克隆兔，部分克隆兔可以存活至成年。目前已經獲得6隻存活的INSR-RNAi克隆兔。對其中的一隻進行Doxycycline誘導實驗發現，INSR-RNAi轉基因兔在注射Dox後可以出現高血糖症狀。 利用不同的轉基因克隆兔進行繁殖，四隻克隆兔分別獲得了後代。通過對不同組的後代進行Doxycycline誘導測試，來源於同一干擾載體的不同克隆兔的後代表現並不相同。我們選擇了I4-2的後代進行繁殖擴群。通過對I4-2的後代進行了Doxycycline誘導高血糖的測試，發現I4-2的轉基因兔後代在飲水中添加500mg/L的Doxycycline和3%的蔗糖的條件下4天以後可以出現高血糖症狀（＞18mmol/L）。對誘導高血糖的轉基因兔的同時進行糖耐量實驗發現I4-2的陽性後代糖耐量和陰性後代無明顯差異，在禁食的情況下後期會出現低血糖。糖尿病兔同時出現了高胰島素血症。RT-PCR顯示Dox存在的情況下INSR的表達量顯著降低，相關糖代謝通路被阻斷。 研究證明，穩定整合INSR-shRNA表達質粒的轉基因細胞可以支持整個胎兒發育，新生轉基因克隆兔可以健康生長至成年。驗證了課題設計的可行性。通過轉基因克隆兔及其後代的doxycycline誘導實驗顯示，在dox的作用下家兔的血糖明顯上升，達到了糖尿病模型指標。該模型兔群體將為Ⅱ型糖尿病病理機制以及糖尿病並發的高脂血症、動脈粥樣硬化、視網膜病變的病理和治療藥物的研究提供基礎。