《II 型cGMP依賴性蛋白激酶的分泌及其細胞外作用靶點》是依託江蘇大學，由陳永昌擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：II 型cGMP依賴性蛋白激酶的分泌及其細胞外作用靶點
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：陳永昌
- 依託單位：江蘇大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
現有資料顯示II型cGMP依賴性蛋白激酶（PKG II）不含信號肽，是分布於細胞內的蛋白激酶。本項目前期研究發現，PKG II定位於細胞的內質網和高爾基體，存在於人及小鼠血清中，能使EGFR胞外段磷酸化，阻斷EGF對EGFR的激活，提示PKG II可能是一個分泌性蛋白激酶。在此基礎上，本項目將研究PKG II分泌的分子機制，特別是其氮端豆蔻醯修飾和胺基酸序列在引導PKG II肽鏈進入“內質網-高爾基體”分泌途徑中的作用；以與EGFR同屬受體酪氨酸激酶（RTK）家族的VEGFR、PDGFR和c-Met為對象， 研究PKG II 是否通過使這些RTKs胞外段發生磷酸化而抑制它們的激活，進一步探討PKG II的胞外靶點。研究將闡明一條新的蛋白質分泌途徑，並有助於開闢蛋白激酶研究的新領域。
結題摘要
細胞外蛋白質的磷酸化是機體蛋白質磷酸化修飾的重要組成部分，具有重要的生物學意義。分泌性蛋白激酶是這一修飾的執行者，是一新興的研究領域。本項目在發現II型cGMP依賴性蛋白激酶G（PKG II）是一種新的分泌性蛋白激酶的基礎上，對PKG II的分泌機制進行了系統、深入的研究，對分泌性PKG II的細胞外作用靶點進行了初步的探索。（1）PKG II分泌機制方面，免疫共沉澱、雷射共聚焦顯微鏡和ELISA等檢測結果表明，PKG II是通過常規的蛋白質分泌途徑（Conventional protein secretion pathway）分泌的，儘管它沒有經該途徑分泌所需的信號肽。位點突變和構建剪接體的實驗結果證實，PKG II的分泌依賴於它的胺基酸鏈第二位甘氨酸2（G2）的豆蔻醯修飾和其後的第3-30位胺基酸序列。豆蔻醯化的G2和第3-30位胺基酸共同起了“信號肽”的作用，誘導新合成的PKG II胺基酸鏈進入內質網，通過常規蛋白質分泌途徑分泌。（2）分泌性PKG II胞外作用靶點方面，Western blotting、免疫共沉澱等實驗結果證明：在細胞水平，重組PKG II（模擬分泌性PKG II）能與胃癌細胞受體酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases, RTKs）家族的主要成員EGFR、VEGFR2、PDGFRβ和c-MET結合，使它們發生絲/蘇氨酸磷酸化，進而抑制相應的生長因子（EGF、VEGF、PDGF、HGF等）對這些RTKs和它們下游的關鍵信號轉導分子ERK、Akt等的激活；在分子水平，重組PKG II蛋白能與重組各RTKs胞外段蛋白結合，並引起它們絲氨酸/蘇氨酸磷酸化。蛋白激酶磷酸化位點預測和位點突變結果顯示，EGFR胺基酸鏈的406位蘇氨酸是重組PKG II 使EGFR發生磷酸化並阻斷其激活的特異性作用位點；其他RTKs的PKG II 特異的磷酸化位點也已預測出，正在檢測中。另外，在裸鼠移植瘤模型，實驗結果顯示重組PKG II能抑制胃癌細胞移植瘤的生長；在細胞增殖實驗，結果顯示重組PKG II能抑制胃癌、結腸癌、肝癌、乳腺癌細胞株的增殖。本項目的研究闡明了PKG II 的分泌機制，揭示了一種新的蛋白質分泌模式；研究還證實了重組PKG II對RTKs的激活和腫瘤細胞增殖的抑制，初步探明了分泌性PKG II的胞外作用靶點。
