HPV6b編碼的miRNA促進HPV感染細胞免疫逃逸的分子機制

《HPV6b編碼的miRNA促進HPV感染細胞免疫逃逸的分子機制》是依託浙江大學，由劉曉艷擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：HPV6b編碼的miRNA促進HPV感染細胞免疫逃逸的分子機制
• 依託單位：浙江大學
• 項目負責人：劉曉艷
• 項目類別：青年科學基金項目

項目摘要

研究證實病毒編碼的miRNA在病毒感染宿主過程中對病毒複製和宿主細胞防禦功能起著重要作用，尋找miRNA及其靶基因的研究正成為基因調控領域的重要分支和熱點。本研究在我們前期預測及定製高通量miRNA晶片篩選的基礎上，將利用miRNA線上軟體推測和計算HPV6b編碼的miRNA所調控的靶基因，並確定出目標HPV6b-miRNA；進一步合成miRNA和miRNA inhibitor，揭示目標HPV6b-miRNA對免疫逃逸相關信號通路中靶基因的調控作用。試圖從全新視角闡明特異性HPV病毒編碼的miRNA是HPV免疫逃逸、尖銳濕疣（CA）反覆發作的新的分子機制，探索今後開發miRNA藥物治療CA的可能性和可行性，為發現能阻斷CA反覆發生的新靶點提供實驗依據，完善和豐富性病領域的治療方法，拓展病毒感染基因治療的新思路。

結題摘要

1. CA樣本中miRNA的差異表達 （1）miRNA晶片篩選出表達上調或下調4倍以上且陽性信號反應值＞500的13個miRNA作為差異表達miRNA，其中以miR-31表達增高最為顯著。 （2） 螢光定量PCR擴大驗證證實除了miR-195和miR-30b表達無明顯差異外，其餘miRNA均有差異表達，其中miR-31表達增高最為顯著。miR-31的表達與發作次數和病程密切相關，且與病程呈正相關。 （3）構建出CA差異表達miRNA-基因調控網路圖。 2. miR-31對HPV感染細胞及角質形成細胞增殖、凋亡以及細胞因子表達的影響，及其調控靶基因的篩選和驗證 （1）成功構建了表達pre-miR-31模擬物和miR-31抑制物的重組慢病毒。建立了穩定感染並表達pre-miR-31模擬物和抑制物的HeLa細胞、SiHa細胞和HaCaT細胞。 （2）MTT結果顯示穩定表達miR-31模擬物和抑制物的HeLa細胞、SiHa細胞組間細胞增殖和活力無顯著差異，時序性miR-31差異表達組間細胞增殖無明顯差異。Annexcin-V-PE凋亡檢測結果顯示穩定表達miR-31模擬物和抑制物的HeLa細胞和SiHa細胞組間凋亡細胞比例無顯著差異。 （3）ELISA結果顯示，在poly（I:C）的協同刺激下，miR-31抑制物能夠促進HeLa和SiHa細胞分泌炎症細胞因子IL-1β和IL-6、趨化因子IL-8、CXCL-1和RANTES以及I型干擾素IFN-α和IFN-β；能夠促進HaCaT細胞分泌炎症細胞因子IL-1β和IL-6、趨化因子IL-8、CXCL-1和RANTES以及I型干擾素IFN-β和II型干擾素IFN-γ。 （4）根據差異表達miR-31的HeLa細胞組間基因差異表達譜的結果，結合軟體預測結果篩選出miR-31可能調控的下游靶基因——MAP3K1、MAP3K14、MAP4K5、HLA-A、IRF1和PKC等，差異基因位於MAPK/NFκB信號通路上。螢光定量PCR檢測及westernblot實驗證實差異表達miR-31組間MAP3K1的表達有顯著差異。 （5）成功構建出MAP3K1 3’UTR野生型和突變型載體。螢光素酶報告實驗顯示miR-31模擬物對野生型載體中的報告螢光有明顯的下調作用；對其預測靶位點進行突變後，突變型載體中的報告螢光有所恢復。