《Furin在牙本質形成以及相關疾病中作用的實驗研究》是依託中國人民解放軍第四軍醫大學，由王捍國擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：Furin在牙本質形成以及相關疾病中作用的實驗研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：王捍國
- 依託單位：中國人民解放軍第四軍醫大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
牙本質基質蛋白的裂解活化在牙本質形成中具有重要作用，發生異常導致礦化不良，至今機理尚不明確。我們的研究發現：前蛋白轉化酶furin裂解活化牙本質基質蛋白MEPE；牙本質中主要的基質蛋白DSPP也是furin的底物。我們提出假說：牙本質形成中，furin裂解活化DSPP形成DSP和DPP，調控牙本質基質形成和礦化。本研究首先構建furin過表達和基因敲除的成牙本質細胞系，分析DSPP裂解活化和體外牙本質形成情況；然後利用Cre/loxP系統，構建成牙本質細胞特異性的furin基因敲除小鼠，分析體內DSPP裂解活化情況和牙本質表型，包括牙本質生長速度、力學性能、組織學和基質蛋白情況等；最後收集牙本質發育性疾病患牙，檢測furin活性和DSPP裂解活化情況。本課題將闡明furin裂解活化DSPP過程，明確基質蛋白翻譯後修飾在牙本質形成中作用，揭示牙本質發育性疾病的可能致病機理，為其防治提供思路。
結題摘要
牙本質形成是牙齒髮育的重要階段，也是牙本質牙髓複合體損傷修復過程中的關鍵環節。成牙本質細胞分化成熟後，分泌細胞外基質蛋白形成牙本質基質，調控羥基磷灰石晶體的成核和聚集，牙本質礦化形成。本項目提出DSPP裂解活化模型，即furin在成牙本質細胞內裂解DSPP形成DSP和DPP，調控牙本質細胞外基質的形成，影響牙本質礦化過程，是牙本質發育不全的可能致病途徑。本研究從牙本質細胞外基質蛋白翻譯後修飾的角度探討牙本質形成的機制，為疾病的防治提供思路。 1. furin裂解DSPP蛋白質形成DSP和DPP。將外源性DSPP轉染furin基因缺陷性人結腸癌細胞系LoVo細胞中，僅有全長DSPP蛋白質表達。體外酶解實驗證實furin可以裂解DSPP蛋白質形成DSP和DPP。 2. 體外furin 裂解活化DSPP，調控牙本質形成。構建furin基因過表達穩定細胞系OLC-furin和基因沉默的穩定細胞系OLC-furin-miR。分析DSPP裂解和牙本質形成情況，結果顯示：OLC-furin中DSPP的裂解情況與對照組OLC無明顯差異，無DSPP全長，具有相似的礦化能力；OLC-furin-miR中則基本為DSPP全長，僅有少量DSP片段，同時礦化能力較低。表明furin是DSPP裂解活化的重要蛋白酶，在成牙本質細胞內裂解DSPP形成DSP和DPP，並分泌至細胞外。 3. 體內furin 裂解活化DSPP，調控牙本質形成。進口Furin KO-first小鼠胚胎以及DSPP-Cre活體小鼠，Furin KO-first小鼠胚胎雜交Flp工具鼠後即為Furin CKO小鼠，再與DSPP-Cre小鼠雜交篩選獲得子代furin（-/-）Cre（+），即為牙本質細胞特異性furin條件性基因敲除小鼠。表型分析結果：CKO小鼠出生後3天、7天、14天磨牙牙胚中存在DSPP全長蛋白，提示DSPP未完全裂解；牙本質層比野生型薄，與成牙本質細胞之間有間隙，牙本質小管結構不完整，成牙本質細胞排列方向散亂。出生後21天、28天的CKO小鼠與對照組相比無明顯差異。 4. Furin在遺傳性牙本質發育不良的可能致病機理。收集遺傳性牙本質發育不良患者的脫落乳牙以及正畸原因拔除的恆牙，收集牙本質基質蛋白，與正常牙齒比較，Western blot顯示發現患牙牙本質中存在DSPP全長蛋白，提示DSPP未完全裂解。
