Fbx4剪接突變與腫瘤細胞周期素D1降解異常研究

《Fbx4剪接突變與腫瘤細胞周期素D1降解異常研究》是依託北京大學，由陳香梅擔任負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：Fbx4剪接突變與腫瘤細胞周期素D1降解異常研究
• 項目負責人：陳香梅
• 依託單位：北京大學
• 項目類別：青年科學基金項目

項目摘要

細胞周期素D1（Cyclin D1）是調控細胞由G0/G1期進入S期的重要因子，其過量表達與多種人類腫瘤相關。Cyclin D1降解異常所致過表達與其致癌作用的關係越來越受關注。研究表明Cyclin D1主要經SCF Fbx4/aB-crystallin泛素連線酶介導的泛素-蛋白酶體降解，該複合體中Fbx4蛋白以二聚體的形式識別並結合T286位磷酸化的Cyclin D1。目前已經發現的人類Fbx4有兩個剪接變異體。我們近期發現，除已知的變異體外，腫瘤細胞中還存在多個新的Fbx4剪接突變體，初步研究證實突變體過表達能導致Cyclin D1穩定性增加。本課題將通過研究各種剪接突變體形成二聚體能力，與a-B crystalin、Skp1形成複合物並降解Cyclin D1蛋白的能力，及對細胞生長和增殖的影響，闡明Fbx4剪接變異體的功能特點及在腫瘤發生中的作用，為進一步揭示腫瘤發生機制提供線索。

結題摘要

細胞周期素D1（cyclin D1）是細胞周期進程的正性調節因子，在多種腫瘤中過表達，但機制尚未完全闡明。Cyclin D1 的降解由泛素化酶蛋白複合體SCFFbx4αB-crystallin介導完成，其中Fbx4和αB-crystallin可特異結合待降解的靶蛋白，決定了這一複合體的靶點和特異性。已有研究表明，在部分cyclin D1高表達的腫瘤中，Fbx4蛋白水平有不同程度的下降，提示Fbx4的表達異常可能是cyclin D1過表達的重要機制。本研究旨在進一步探索Fbx4在腫瘤中的異常表達、異常剪接及其對cyclin D1降解的影響。本研究採用實時螢光定量PCR和Western Blot方法，首次證實肝癌組織中Fbx4 的mRNA和蛋白水平均顯著低於癌旁組織。採用克隆測序方法發現，人類組織中除了還有野生型Fbx4α和截短的Fbx4β外，還有Fbx4-168-245del（Fbx4γ），Fbx4-exon2del和Fbx4-exon6del（Fbx4δ），且這些剪接異構體的表達在腫瘤組織中顯著高於正常組織。我們構建了各剪接異構體的表達質粒，通過分子生物學實驗和細胞生物學方法研究了這些變異體的生物學功能。結果顯示，在NIH3T3和肝癌細胞SK-Hep1中過表達這些變異體能顯著增加細胞內cyclin D1蛋白的水平，延長cyclin D1蛋白半衰期。與此相一致，這些變異體可促進細胞在軟瓊脂中的集落形成及遷移能力。不同於野生型Fbx4主要分布於細胞漿中的特性，Fbx4γ、Fbx4δ和Fbx4β在細胞漿和細胞核中均有分布。上述結果提示本研究新發現的這些Fbx4剪接變異體可能具有不同於野生型Fbx4的癌基因功能。Fbx4-C24G（rs2231917）是存在於人類基因組中的單核苷酸多態性，可使Fbx4第8位胺基酸由S變為R。我們證實rs2231917是一個功能性多態，Fbx4R8可通過定位在細胞漿進而延長cyclin D1的半衰期，並穩定cyclin D1。但因在中國漢族人群中Fbx4-24G的分布頻率很低，其與胃癌、食管癌和肝癌的發生風險之間並無相關性。綜上所述，本研究從蛋白質的異常降解方面闡釋了腫瘤中cyclin D1過表達的機制，具有癌基因功能的Fbx4剪接異構體有望作為腫瘤治療的新靶標。