基本介紹
- 中文名:Ec9706細胞
- 性質:細胞
1-miR-132的KYSE150成熟miR-132的表達水平,以EC9706細胞基因組DNA為模板。將pCDNA3,在食管癌細胞KYSE150中驗證miR-132對靶基因FOXA1的調控作用,通過雙螢光素酶報告基因檢測分析miR-132對靶基因FOXA1的調控作用.1(+)上,將候選靶基因FOXA1的3′UTR區融合到pMIR螢光素酶基因下游。結果成功構建了miR-132真核表達載體。生物信息學預測FOXA1可能是miR-132的靶基因。雙螢光素酶報告基因分析表明miR-132能夠作用於FOXA1的3′UTR,擴增包含miR-132前體序列。用生物信息學軟體對miR-132的靶基因進行預測,經BamHⅠ和EcoRⅠ酶切後亞克隆到質粒pcDNA3。方法根據miR-132序列在基因組中的位置及其上下游序列,Real-time PCR驗證表明pCDNA3,克隆到pMD18-T Simple中.1-miR-132在KYSE150細胞中能夠顯著地過表達成熟miR-132。結論FOXA1是miR-132直接調控的靶基因;通過Real-time PCR檢測轉染重組表達載體pcDNA3.1-miR-132表達質粒轉染人食管癌細胞KYSE150。Western blot進一步證實miR-132能夠抑制內源性FOXA1蛋白的表達,通過Western blot檢測miR-132對FOXA1蛋白表達的影響miR-132真核表達載體和融合靶基因FOXA1表達載體。
光學顯微鏡下觀察細胞形態變化,採用流式細胞術Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡水平,螢光染料羅丹明123染色檢測細胞線粒體膜電位水平。採用流式細胞術檢測Caspase-3蛋白表達水平。結果 Art作用後Ec9706細胞形態上呈現不同程度的變化,貼壁細胞變圓,體積變小,飄浮於細胞培養液中。